<![CDATA[耄耋翁生物免疫工作室Bio-immune studio]]> 我,老白龙马,1940年生于祖国东北;56年学医于西北,61年入伍行医于西部核基地,身患核辐射病后68年退役;本人从事半个世纪医学生物,工作单位:兰州生物制品研究所,退休后和患老年痴呆症老伴相依为命,老伴去世后以电脑为伴,漫游地球村:http://liuyr.blog.bokee.net/
 

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bokee.net Copyright (c) 2005, www.bokee.net 普通一兵《免疫点亮生命之光》 2017-06-17T16:45:45 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://28851576  普通一兵《免疫点亮生命之光》

 

春蚕到死丝方尽 年华莫虚度 夕阳唱晚 核辐射细胞变异癌症身 死生几度阎罗愁 生物抗癌斗艾滋 生活坎坷 一介草民平淡平安 笑面对

 

蜡炬成灰泪始干 碌碌要有为 耄耋创业 有梦想晚年余生抖精神 风烛残年死无惧 免疫健体又强身 酸甜苦辣 知足常乐一杯清茶 一缕烟

 

 

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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr 生物医学  普通一兵《免疫点亮生命之光》

 

春蚕到死丝方尽 年华莫虚度 夕阳唱晚 核辐射细胞变异癌症身 死生几度阎罗愁 生物抗癌斗艾滋 生活坎坷 一介草民平淡平安 笑面对

 

蜡炬成灰泪始干 碌碌要有为 耄耋创业 有梦想晚年余生抖精神 风烛残年死无惧 免疫健体又强身 酸甜苦辣 知足常乐一杯清茶 一缕烟

 

 

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生物免疫制剂 Bio-immune preparation 2017-02-12T12:28:36 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://28079182  生物免疫制剂

.生物
各种疾病,癌症,艾滋病辅助康复
.生物膜
烧伤,烫伤,溃疡
.生物棒
阴道感染,溃疡

 

Bio-immune preparation
1. Bio-fluid
 variety of diseases, cancer, AIDS  assist  recovery
2. Bio-film
Burns, burns, ulcers
3. Bio-
rods
Vaginal infections, ulcers

 

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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr 生物医学  生物免疫制剂

.生物
各种疾病,癌症,艾滋病辅助康复
.生物膜
烧伤,烫伤,溃疡
.生物棒
阴道感染,溃疡

 

Bio-immune preparation
1. Bio-fluid
 variety of diseases, cancer, AIDS  assist  recovery
2. Bio-film
Burns, burns, ulcers
3. Bio-
rods
Vaginal infections, ulcers

 

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我看“世界末日” 2012-12-17T12:42:40 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://13077786
我看“世界末日”
早上8点永登小芳(她是带过我孙子的小阿姨)打电话询问12月21日“世界末日”,说地球要连续3天3夜的黑暗,是真的吗?大家都在买蜡烛,她也买了3根。我告诉她是骗人的,什么都不会发生,会和平时一样,她说:电视上都说是真的了,我说你放心吧,地球毁灭,根本就没有这回事。
看来玛雅预言“世界末日'在全球是有一定影响的,只有平安度过12.21才能有效打破谣言。
我的小孙子才3岁多,动不动也会因为一点小麻烦就说:“世界末日”了!
我的一生也有过许许多多的“世界末日”……
早在上个世纪40年代,我七、八岁的时候,母亲因为严重肺结核,肝腹水,我亲眼看着妈妈痛苦挣扎的去世,那时候真是我的“世界末日”;
50年代末,大跃进随之而来的3年天灾人祸,饥肠辘辘,甘肃,全国有多少人饿死,甚至人吃人,我从学校毕业的时候所有的被褥衣服全部被盗,只身到单位工作,孤苦伶仃,举目无亲,那才是“世界末日”哪!
60年代初,我为了吃饱肚子报名参军,到大西北飞沙走石的茫茫戈壁滩,在青海白雪皑皑,雪域高原,青海湖畔,我在两个核基地做了7年多“士兵军医”,同样饿肚子,没日没夜的奔波在各个连队驻地为战友治病,不幸几年之后就得了放射病,肝大脾大,甲状腺肿大,几次住院治疗无果,再坚持工作,2年的兵役期我超期干了7年多,连女友也飞了,看来,在我面前只有死路一条啦!这不是“世界末日”来临了吗!?
70年代,我从部队回到原单位兰州生物制品研究所工作,正赶上文化大革命政治浩劫,天昏地暗,乌烟瘴气,群魔乱舞,人妖不分,我虽然没被关进“牛棚”,也被送去“拉马”,以重体力危险工作使我在精神和肉体同时受到折磨,在被逼迫承认“错误”之后,让我回到一个代血浆班组报到上班,通知我那天早上8点准时报到,我心里赌气:“你今天叫老子去报到,老子今天就是不去!看你能把老子怎么样!?”,没想到,苍天保佑,因为赌气,我竟然阴差阳错地躲过生死一劫!谁能知道,就在8点钟准时,那个班组发生酒精蒸汽大爆炸!整个生产大楼都晃动了,死伤数人,局部墙壁坍塌,玻璃钢窗架子被甩出好远,玻璃窗粉碎,一片狼藉,血迹斑斑,这爆炸的时间和班组恰好就是我报到的时间和地点,按时去了就是我必死无疑的宿命!这不是千真万确的“世界末日”吗!!!
80年代,一次我的领导让我出差去武山,我准备妥当,可当时科室一位女同志要求我,她想去看插队的孩子,她想代替我出差,我只好答应了,没想到,出差坐所里的小车在半路上翻车出了事故,那位女同志受伤摔骨折,我确在家安然无恙,我为别人代我受伤而感到内疚,如果是我去武山,也可能出差翻车送命,那岂不又是“世界末日”了!?
90年代,我因为患不全肠梗阻,几日体重下降36斤,血压80/40,生命垂危,紧急住院,各种治疗方法无效,疼痛难忍,不能进食,不能排泄,亲人痛苦,亲朋好友看我之后摇头,都说:“不行了”,阎王爷在向我招手,眼看“世界末日”来临!
后来我自己拒绝住院治疗,回家等死,确在一夜之间突然好转,迅速康复痊愈,大夫也莫名其妙,惊呼怪哉!我想,可能是因为我命不该绝,多亏前日大夫和护士直肠镜硬性强迫检查,可能是塑料镜头打通了我的梗阻部位,竟然是“歪打正着”,奇迹般治愈了我的“绝症”吧。
2008年,四川省汶川大地震,在卫星通信工作的儿子瞒着父母和解放军一道进入地震灾区,一直在最需要,最危险的地方救灾,在最艰险唐家山堰塞湖大坝即垮塌的危机时刻,我们的儿子勇敢地从解放军直升飞机投落下来,冒死完成为总部领导及时监控险情的重要任务,“火线”入党。这一切,好像老伴和儿子是心灵相通的,老伴看电视一直说儿子一定在汶川!儿子的生死和父母心连心,那日日夜夜,提心吊胆,祝福祈祷上苍保佑,儿子平安归来,在父母心里一旦失去了儿子,就是“世界末日”啊!
进入21世纪,我是最真实的感到“世界末日”了,2012年春节,大年初一晚上我老伴平静,安详地停止了呼吸,停止了心跳,离开我和孩子,独自去天堂了,今年是我和老伴的本命年,73岁也是人生寿命的一个重要的“坎”,俗话说“七十三八十四阎王不叫自己去!”,人过古稀,随时随地要有思想准备,准备去天堂报到。
人生“以死为大”,我愿意用我的生命去延续老伴的寿命,可这是做不到的,寿命不是像器官移植那样,交换了就可以拯救生命的,寿命是有定数的,我和老伴互相搀扶幸福、快乐、痛苦、悲伤、艰难地走过了44个年头。
老伴晚年虽然患了严重糖尿病、高血压、晚期老年痴呆,但她始终是没有痛苦,吃喝拉撒睡,大小便,在我的帮助下,许多病症保持缓解和稳定,基本上都能自理,没给我和孩子造成多大的负担,精神意识一直清楚,记忆清晰。孩子也非常孝顺,老伴没有遗憾,没有牵挂,心满意足地走了,这也是老伴终生积德行善的善报,善果,年过古稀,也算是相对长寿了,没有痛苦,没有拖累,就好像做梦去极乐世界旅游一样,这不就是人类梦寐以求的死亡最崇高境界嘛!?可这对于我来说确实是“世界末日”!
这是我从没有经历过的,别人不能替代,不能减轻的撕心裂肺的痛苦,伤心之极,我虽然为老伴及时地建立了网络纪念馆,可以天天和老伴见面,说话,聊天,我写了60多篇祭文,向老伴倾诉心里话,天天可以看到老伴生前的面容,我天天可以为老伴烧香、点燃蜡烛、献花,在老伴过世的11个月漫长日子里有一万六千多网友拜祭她,这样,我心里有了一丝慰藉,但还是心里感到空荡荡,无依无靠了,孤家寡人了,现在我才真真切切地感到什么是孤独,什么是空巢,什么是悲痛,什么是“世界末日”了!!!
为了让死者安心,安息,安慰,我还要振作起来,为了孩子,为了家庭,继续完成老伴的未了心愿,我还要继续生活下去,就是真的有“世界末日”,地球爆炸来临,我也会从容面对,那样更好,我就可以永远陪伴老伴,永不分离了。
我等待,期待,迎接我死亡这一天,属于我的真正的“世界末日”!
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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr 生活
我看“世界末日”
早上8点永登小芳(她是带过我孙子的小阿姨)打电话询问12月21日“世界末日”,说地球要连续3天3夜的黑暗,是真的吗?大家都在买蜡烛,她也买了3根。我告诉她是骗人的,什么都不会发生,会和平时一样,她说:电视上都说是真的了,我说你放心吧,地球毁灭,根本就没有这回事。
看来玛雅预言“世界末日'在全球是有一定影响的,只有平安度过12.21才能有效打破谣言。
我的小孙子才3岁多,动不动也会因为一点小麻烦就说:“世界末日”了!
我的一生也有过许许多多的“世界末日”……
早在上个世纪40年代,我七、八岁的时候,母亲因为严重肺结核,肝腹水,我亲眼看着妈妈痛苦挣扎的去世,那时候真是我的“世界末日”;
50年代末,大跃进随之而来的3年天灾人祸,饥肠辘辘,甘肃,全国有多少人饿死,甚至人吃人,我从学校毕业的时候所有的被褥衣服全部被盗,只身到单位工作,孤苦伶仃,举目无亲,那才是“世界末日”哪!
60年代初,我为了吃饱肚子报名参军,到大西北飞沙走石的茫茫戈壁滩,在青海白雪皑皑,雪域高原,青海湖畔,我在两个核基地做了7年多“士兵军医”,同样饿肚子,没日没夜的奔波在各个连队驻地为战友治病,不幸几年之后就得了放射病,肝大脾大,甲状腺肿大,几次住院治疗无果,再坚持工作,2年的兵役期我超期干了7年多,连女友也飞了,看来,在我面前只有死路一条啦!这不是“世界末日”来临了吗!?
70年代,我从部队回到原单位兰州生物制品研究所工作,正赶上文化大革命政治浩劫,天昏地暗,乌烟瘴气,群魔乱舞,人妖不分,我虽然没被关进“牛棚”,也被送去“拉马”,以重体力危险工作使我在精神和肉体同时受到折磨,在被逼迫承认“错误”之后,让我回到一个代血浆班组报到上班,通知我那天早上8点准时报到,我心里赌气:“你今天叫老子去报到,老子今天就是不去!看你能把老子怎么样!?”,没想到,苍天保佑,因为赌气,我竟然阴差阳错地躲过生死一劫!谁能知道,就在8点钟准时,那个班组发生酒精蒸汽大爆炸!整个生产大楼都晃动了,死伤数人,局部墙壁坍塌,玻璃钢窗架子被甩出好远,玻璃窗粉碎,一片狼藉,血迹斑斑,这爆炸的时间和班组恰好就是我报到的时间和地点,按时去了就是我必死无疑的宿命!这不是千真万确的“世界末日”吗!!!
80年代,一次我的领导让我出差去武山,我准备妥当,可当时科室一位女同志要求我,她想去看插队的孩子,她想代替我出差,我只好答应了,没想到,出差坐所里的小车在半路上翻车出了事故,那位女同志受伤摔骨折,我确在家安然无恙,我为别人代我受伤而感到内疚,如果是我去武山,也可能出差翻车送命,那岂不又是“世界末日”了!?
90年代,我因为患不全肠梗阻,几日体重下降36斤,血压80/40,生命垂危,紧急住院,各种治疗方法无效,疼痛难忍,不能进食,不能排泄,亲人痛苦,亲朋好友看我之后摇头,都说:“不行了”,阎王爷在向我招手,眼看“世界末日”来临!
后来我自己拒绝住院治疗,回家等死,确在一夜之间突然好转,迅速康复痊愈,大夫也莫名其妙,惊呼怪哉!我想,可能是因为我命不该绝,多亏前日大夫和护士直肠镜硬性强迫检查,可能是塑料镜头打通了我的梗阻部位,竟然是“歪打正着”,奇迹般治愈了我的“绝症”吧。
2008年,四川省汶川大地震,在卫星通信工作的儿子瞒着父母和解放军一道进入地震灾区,一直在最需要,最危险的地方救灾,在最艰险唐家山堰塞湖大坝即垮塌的危机时刻,我们的儿子勇敢地从解放军直升飞机投落下来,冒死完成为总部领导及时监控险情的重要任务,“火线”入党。这一切,好像老伴和儿子是心灵相通的,老伴看电视一直说儿子一定在汶川!儿子的生死和父母心连心,那日日夜夜,提心吊胆,祝福祈祷上苍保佑,儿子平安归来,在父母心里一旦失去了儿子,就是“世界末日”啊!
进入21世纪,我是最真实的感到“世界末日”了,2012年春节,大年初一晚上我老伴平静,安详地停止了呼吸,停止了心跳,离开我和孩子,独自去天堂了,今年是我和老伴的本命年,73岁也是人生寿命的一个重要的“坎”,俗话说“七十三八十四阎王不叫自己去!”,人过古稀,随时随地要有思想准备,准备去天堂报到。
人生“以死为大”,我愿意用我的生命去延续老伴的寿命,可这是做不到的,寿命不是像器官移植那样,交换了就可以拯救生命的,寿命是有定数的,我和老伴互相搀扶幸福、快乐、痛苦、悲伤、艰难地走过了44个年头。
老伴晚年虽然患了严重糖尿病、高血压、晚期老年痴呆,但她始终是没有痛苦,吃喝拉撒睡,大小便,在我的帮助下,许多病症保持缓解和稳定,基本上都能自理,没给我和孩子造成多大的负担,精神意识一直清楚,记忆清晰。孩子也非常孝顺,老伴没有遗憾,没有牵挂,心满意足地走了,这也是老伴终生积德行善的善报,善果,年过古稀,也算是相对长寿了,没有痛苦,没有拖累,就好像做梦去极乐世界旅游一样,这不就是人类梦寐以求的死亡最崇高境界嘛!?可这对于我来说确实是“世界末日”!
这是我从没有经历过的,别人不能替代,不能减轻的撕心裂肺的痛苦,伤心之极,我虽然为老伴及时地建立了网络纪念馆,可以天天和老伴见面,说话,聊天,我写了60多篇祭文,向老伴倾诉心里话,天天可以看到老伴生前的面容,我天天可以为老伴烧香、点燃蜡烛、献花,在老伴过世的11个月漫长日子里有一万六千多网友拜祭她,这样,我心里有了一丝慰藉,但还是心里感到空荡荡,无依无靠了,孤家寡人了,现在我才真真切切地感到什么是孤独,什么是空巢,什么是悲痛,什么是“世界末日”了!!!
为了让死者安心,安息,安慰,我还要振作起来,为了孩子,为了家庭,继续完成老伴的未了心愿,我还要继续生活下去,就是真的有“世界末日”,地球爆炸来临,我也会从容面对,那样更好,我就可以永远陪伴老伴,永不分离了。
我等待,期待,迎接我死亡这一天,属于我的真正的“世界末日”!
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兰花忆 2012-12-17T12:41:25 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://13077783 兰花忆
    女儿说临洮兰花基地朋友要给老曹送兰花,老五想转送给我,我说我想去临洮兰花基地去看看,女儿说可以啊,过几天我们就去。
    我记得在20年前,兰州东岗开发区兰州大学教授谷祝平,他小我两岁,是我们所宋淑珍的同学,在美国进修兰花,在开发区我和他见过面并看了他们的兰花培养实验室,后来他一直在国内从事兰花的组织培养生产和研究工作。现在,我在网上搜索当时沈阳杨斌金融诈骗,在沈阳北陵小韩屯(我的老家搬迁后的新家居住地)地区建荷兰村,也包括兰花培养,这个地方离沈飞集团附近,他很快成为当时中国第二巨富,后来判刑18年到2020年60多岁才能出狱。他是南京人,编造假经历,空手套白狼。他和青海西宁的胖“总”一样,都是假大空。不过也是有大本事的人。人不老实,最终要吃大亏,锒铛入狱也是必然。
    西方历史上兰花因稀少,名贵曾“价值连城”,促使科学家去致力研究大量快繁技术,这就是后来的植物细胞和组织培养技术。
    我接触此项知识还是在30年前,自己是搞医学生物专业的,因为“上级”掠夺自己的抗癌工作成果精神倍受刺激而去图书馆“发泄”时,在无意中发现一篇文章“魔术般植物细胞和组织培养技术”而感到惊奇,之后陆续翻译了许多这方面的英文资料,特别是大陆首次美国图书展的全部图书有幸留在兰州市省图书馆了,我如饥似渴地翻译,我兴奋,激动,我完全被这崭新领域所吸引。
    当然植物细胞和组织培养和我的细菌病毒克隆技术还是要相通之处的,另外,我从植物细胞和组织培养知识中也领悟到癌细胞的发生和向正常转化的必备条件和过程的基本知识,我把自己的领悟的知识付诸实践,在医院拒绝治疗的晚期癌症等死病人治疗中取得一定效果,大受启发。正是我的“不务正业”反而促使我对癌症的深入了解,自然更是热爱不舍了。这在当时是“冷门”技术,了解的人甚少。
    农业高级学府的“百合组培技术”要价几万,我利用小家简陋条件,热水袋,孩子的小被褥,和大立柜,小台灯,自己配制培养基,分离百合细胞,进行培养试验,一次成功,在玻璃试管里生长了用百合细胞组织到完整的百合植株底全部生命过程。
    省科技情报所的有关领导和同志们和我一起见证了我的能力和努力。
    我验证了生物高科技在家庭有限条件下也是可以进行生物试验的。
    知识积累之后就想“释放”,当时见部队解放军报宣传兰州军区退伍老兵学习技术的报道,我就去兰州军区询问,我想我愿意免费给退伍老兵教授植物细胞和组织培养技术,让他们回农村去实践农业新科技,有关领导真心实意地告诉我说,报纸宣传的是“意思”,不是真实的事情,我只好灰心泄气了。
    我又去雁滩农业科技部门我愿意免费为农民讲授植物细胞组织培养科技知识,领导告诉我,可以啊,这是好事情啊,但你得付给农民耽误地里干活的工钱!天哪,我哪里有钱去请农民来听我“念经”啊!所以只好作罢。

    几十年对植物细胞和组织培养的情感,让我眷恋,几十年我和老伴的兰花忆,愿望即将得以实现,现在女儿要带我去临洮参观兰花了,我想多呆些时日,好好看看,了解兰花组培技术的全部过程,和工作人员交朋友,以了我和老伴对兰花的心愿。

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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr 生活 兰花忆
    女儿说临洮兰花基地朋友要给老曹送兰花,老五想转送给我,我说我想去临洮兰花基地去看看,女儿说可以啊,过几天我们就去。
    我记得在20年前,兰州东岗开发区兰州大学教授谷祝平,他小我两岁,是我们所宋淑珍的同学,在美国进修兰花,在开发区我和他见过面并看了他们的兰花培养实验室,后来他一直在国内从事兰花的组织培养生产和研究工作。现在,我在网上搜索当时沈阳杨斌金融诈骗,在沈阳北陵小韩屯(我的老家搬迁后的新家居住地)地区建荷兰村,也包括兰花培养,这个地方离沈飞集团附近,他很快成为当时中国第二巨富,后来判刑18年到2020年60多岁才能出狱。他是南京人,编造假经历,空手套白狼。他和青海西宁的胖“总”一样,都是假大空。不过也是有大本事的人。人不老实,最终要吃大亏,锒铛入狱也是必然。
    西方历史上兰花因稀少,名贵曾“价值连城”,促使科学家去致力研究大量快繁技术,这就是后来的植物细胞和组织培养技术。
    我接触此项知识还是在30年前,自己是搞医学生物专业的,因为“上级”掠夺自己的抗癌工作成果精神倍受刺激而去图书馆“发泄”时,在无意中发现一篇文章“魔术般植物细胞和组织培养技术”而感到惊奇,之后陆续翻译了许多这方面的英文资料,特别是大陆首次美国图书展的全部图书有幸留在兰州市省图书馆了,我如饥似渴地翻译,我兴奋,激动,我完全被这崭新领域所吸引。
    当然植物细胞和组织培养和我的细菌病毒克隆技术还是要相通之处的,另外,我从植物细胞和组织培养知识中也领悟到癌细胞的发生和向正常转化的必备条件和过程的基本知识,我把自己的领悟的知识付诸实践,在医院拒绝治疗的晚期癌症等死病人治疗中取得一定效果,大受启发。正是我的“不务正业”反而促使我对癌症的深入了解,自然更是热爱不舍了。这在当时是“冷门”技术,了解的人甚少。
    农业高级学府的“百合组培技术”要价几万,我利用小家简陋条件,热水袋,孩子的小被褥,和大立柜,小台灯,自己配制培养基,分离百合细胞,进行培养试验,一次成功,在玻璃试管里生长了用百合细胞组织到完整的百合植株底全部生命过程。
    省科技情报所的有关领导和同志们和我一起见证了我的能力和努力。
    我验证了生物高科技在家庭有限条件下也是可以进行生物试验的。
    知识积累之后就想“释放”,当时见部队解放军报宣传兰州军区退伍老兵学习技术的报道,我就去兰州军区询问,我想我愿意免费给退伍老兵教授植物细胞和组织培养技术,让他们回农村去实践农业新科技,有关领导真心实意地告诉我说,报纸宣传的是“意思”,不是真实的事情,我只好灰心泄气了。
    我又去雁滩农业科技部门我愿意免费为农民讲授植物细胞组织培养科技知识,领导告诉我,可以啊,这是好事情啊,但你得付给农民耽误地里干活的工钱!天哪,我哪里有钱去请农民来听我“念经”啊!所以只好作罢。

    几十年对植物细胞和组织培养的情感,让我眷恋,几十年我和老伴的兰花忆,愿望即将得以实现,现在女儿要带我去临洮参观兰花了,我想多呆些时日,好好看看,了解兰花组培技术的全部过程,和工作人员交朋友,以了我和老伴对兰花的心愿。

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老伴的职称申请表 2012-12-17T12:40:01 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://13077768 我和老伴一起生活了44年,她的职称申请表我一直没看过,还是最近整理老伴的遗物我才发现的,老伴虽然和我是在一个单位工作,她一直是相夫教子,朴实无华,默默无闻,荣辱不惊,无欲无求,她的许许多多生物化学方面的大量工作成绩,她的英语学习和翻译,她的授课,所以这一切,我竟然完全不知道,我为有这样一个伟大老伴而自豪,而我平时还抱怨她不学习,不上进,其实,老伴比我优秀得多啊!她是名副其实的贤妻良母!她只是不显山不露水的平凡高人!老伴是高山我是沙粒,老伴是大海我是水滴啊!
这一切都来的太晚太晚!我忏悔,我悔恨,我这44年算是对不起老伴了,千言万语,万语千言,我只能是在下辈子了报答老伴啦,
 
 
“专业技术职务任职资格申请表”
单位:兰州生物制品研究所检定处生化组
姓名:吕桂荣
现专业技术职务或原职称:主管技师
申请专业技术职务:高级工程师
 
一九八七年七月四日 填
姓名:吕桂荣
性别:女
民族:汉
籍贯:山东省章丘县
出生年月:1941.8.20
参加工作时间:1965.8
从事现专业工作年限:22年
工资级别及工资额:148.0元
何时何单位任现专业职务或获职称:1980年获主管技师职称
最后学历:从1960年至1965年毕业于吉林大学化学系生化专业(修业5年)
国内进修:进修专业内容:免疫学实验技术 起止时间:1983年8月至1983年9月
                        英语                      1977年2月至1978年6月
进修学校:中国,丹麦生物学合作计划,进修生培训中心第二期。
          兰州医学院,教师英语教学班。
专业技术专长或研究方向:生化,免疫学实验技术及应用
外语语种及水平:英文,顺利阅读,翻译专业书刊
参加何学术团体,任何职:参加了生物化学会,并为正式会员
主要社会兼职:所级工会委员
 
主要学历及社会经历
自何年月 至何年月 在何地何学校何单位曾任何职取得何学位学衔职称职务    证明人
1960.9 1965.7 吉林省吉林大学化学系生化专业学习                       曹 阳
1965.8   1987    兰州生物制品研究所生化组工作                         程 夷
1980.            获主管技师职称                                       程 夷
 
1977.1 1978.6   兰州医学院教师英语进修班学习                         张保安
1980.10 1981.8   第一期英语提高班学习(本所)                         卫永义
1985.10 1986.7   英语提高班学习(本所)                               卫永义
1983.8-9         中丹免疫学实验技术培训中心学习                       蔡玲民
 
本人从事专业技术工作的实绩及成果
本人从事的专业技术主要是生化检定,生化及免疫学实验技术的建立和应用。在处长的安排及指导下主要做了如下工作:
1.利用琼脂电泳技术对精破抗纯度及抗体发布进行了分析。此项工作首先对琼脂电泳的条件(缓冲液的种类,PH,离子强度,染色液的种类,琼脂的精制等)进行了摸索,找到了一个适合常规琼脂电泳的固定条件,并对生产的近百批精破抗进行了纯度检定,并配合处长写出了报告,刊登在本所生物制品资料上。写出了操作细则为我所生化组以后的琼脂电泳提供方法资料。
2.淀粉胶电泳方法的建立和应用。经过查阅资料,自制成胶膜,摸索马铃薯淀粉水解条件,最终建立此项技术并应用于检测制品的质量分析及科研。特别是应用在血液制剂丙球及白蛋白质量分析上。(总结刊登在本所生物制品资料上),此法的具体操作也刊登在生物化学及生物物理进展的区带电泳技术讲座上。也接待了外单位的学习,推广了应用。(江西农学院,贵州农学院)
3.琼脂免疫电泳,单向(火箭)双向(交叉)免疫电泳,垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳,微细凝胶薄层层析技术,全部自己摸索实验,配合生产和科研进行质量和结果的分析,特别是免疫球蛋白的提纯工作初期做了大量的免疫电泳分析工作。
4.开展了酶联免疫吸附实验的工作,其中包括免疫血清的装备,(动物的免疫,抗体效价的测定,抗体的提纯)酶标抗体的准备,酶联免疫吸附实验条件的摸索等。(总结刊登在本所科学技术年刊上)同时,本人也总结整理为常规检定细则,应用于疫苗生产中残余牛血清含量的测定。此法为我所最早建立和应用的单位,也接受了所内外的来人学习。
5.微量蛋白质含量测定方法的摸索,近年来新制品很多,蛋白质含量又是其质量指标的关键,现有的经典凱氏定氮等方法已不能满足快速,微量的要求。所以,我们对乙肝疫苗,出血热试制疫苗等,进行了Lowzy法,TCA-Lowzy法及TCA-Kjeloth法检测蛋白质含量的比较,特别对成品采用TCA-Lowzy法进行检测时不同溶解温度进行了实验,基本建立了TCA-Lowzy测乙肝疫苗成品的蛋白含量,为生产和质量控制提供了方法和数据。(现已总结在乙肝生产总结和会议资料上)同时建立此法也接受了兄弟所来学习。
6.常规检定工作:
a.冻干血浆生产献血员筛选的血液化验工作,能及时完成任务,并能查阅资料结合外单位方法,总结整理了当时最快速的血液化验细则,为此项工作提供了方法和资料。同时给血站人员进行有关检验方面的讲课。
b.冻干制品残余水分含量的测定工作量比较大,试剂均由自己配制,能够解决出现的问题,多年检定结果证明制品此项合格率99%以上,对封口前,中,后三阶段试验有差异,但合格制品对此差异无关紧要。
c.参加了乙肝疫苗,出血热疫苗,百日咳组分菌苗试制工作的生化检定工作。对麻疹,乙脑,狂犬疫苗生产中残余牛血清含量的检定对于质量控制起到了监督作用。
d.在工作中,结合实验查阅了大量资料,其中有两篇刊登在本所译刊上,另外还翻译了Beckmon CDS-200型密度计说明书,ORION 1020型钾钠分析仪说明书近5千多字。
e.参加了所办三次生物制品班及兰大免疫学技术的讲课工作,其中自编教材及授课,能圆满完成任务受到好评。
刊登在微生物学免疫学译刊的两篇译文:
“用酶联免疫吸附法测定白喉毒素的抗体”1980.第三期
“蛋白A酶免疫分析法用于筛选杂交瘤的发展”1982.第四期
 
                    本人签名:吕桂荣         1987年7月4日
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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr 生活 我和老伴一起生活了44年,她的职称申请表我一直没看过,还是最近整理老伴的遗物我才发现的,老伴虽然和我是在一个单位工作,她一直是相夫教子,朴实无华,默默无闻,荣辱不惊,无欲无求,她的许许多多生物化学方面的大量工作成绩,她的英语学习和翻译,她的授课,所以这一切,我竟然完全不知道,我为有这样一个伟大老伴而自豪,而我平时还抱怨她不学习,不上进,其实,老伴比我优秀得多啊!她是名副其实的贤妻良母!她只是不显山不露水的平凡高人!老伴是高山我是沙粒,老伴是大海我是水滴啊!
这一切都来的太晚太晚!我忏悔,我悔恨,我这44年算是对不起老伴了,千言万语,万语千言,我只能是在下辈子了报答老伴啦,
 
 
“专业技术职务任职资格申请表”
单位:兰州生物制品研究所检定处生化组
姓名:吕桂荣
现专业技术职务或原职称:主管技师
申请专业技术职务:高级工程师
 
一九八七年七月四日 填
姓名:吕桂荣
性别:女
民族:汉
籍贯:山东省章丘县
出生年月:1941.8.20
参加工作时间:1965.8
从事现专业工作年限:22年
工资级别及工资额:148.0元
何时何单位任现专业职务或获职称:1980年获主管技师职称
最后学历:从1960年至1965年毕业于吉林大学化学系生化专业(修业5年)
国内进修:进修专业内容:免疫学实验技术 起止时间:1983年8月至1983年9月
                        英语                      1977年2月至1978年6月
进修学校:中国,丹麦生物学合作计划,进修生培训中心第二期。
          兰州医学院,教师英语教学班。
专业技术专长或研究方向:生化,免疫学实验技术及应用
外语语种及水平:英文,顺利阅读,翻译专业书刊
参加何学术团体,任何职:参加了生物化学会,并为正式会员
主要社会兼职:所级工会委员
 
主要学历及社会经历
自何年月 至何年月 在何地何学校何单位曾任何职取得何学位学衔职称职务    证明人
1960.9 1965.7 吉林省吉林大学化学系生化专业学习                       曹 阳
1965.8   1987    兰州生物制品研究所生化组工作                         程 夷
1980.            获主管技师职称                                       程 夷
 
1977.1 1978.6   兰州医学院教师英语进修班学习                         张保安
1980.10 1981.8   第一期英语提高班学习(本所)                         卫永义
1985.10 1986.7   英语提高班学习(本所)                               卫永义
1983.8-9         中丹免疫学实验技术培训中心学习                       蔡玲民
 
本人从事专业技术工作的实绩及成果
本人从事的专业技术主要是生化检定,生化及免疫学实验技术的建立和应用。在处长的安排及指导下主要做了如下工作:
1.利用琼脂电泳技术对精破抗纯度及抗体发布进行了分析。此项工作首先对琼脂电泳的条件(缓冲液的种类,PH,离子强度,染色液的种类,琼脂的精制等)进行了摸索,找到了一个适合常规琼脂电泳的固定条件,并对生产的近百批精破抗进行了纯度检定,并配合处长写出了报告,刊登在本所生物制品资料上。写出了操作细则为我所生化组以后的琼脂电泳提供方法资料。
2.淀粉胶电泳方法的建立和应用。经过查阅资料,自制成胶膜,摸索马铃薯淀粉水解条件,最终建立此项技术并应用于检测制品的质量分析及科研。特别是应用在血液制剂丙球及白蛋白质量分析上。(总结刊登在本所生物制品资料上),此法的具体操作也刊登在生物化学及生物物理进展的区带电泳技术讲座上。也接待了外单位的学习,推广了应用。(江西农学院,贵州农学院)
3.琼脂免疫电泳,单向(火箭)双向(交叉)免疫电泳,垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳,微细凝胶薄层层析技术,全部自己摸索实验,配合生产和科研进行质量和结果的分析,特别是免疫球蛋白的提纯工作初期做了大量的免疫电泳分析工作。
4.开展了酶联免疫吸附实验的工作,其中包括免疫血清的装备,(动物的免疫,抗体效价的测定,抗体的提纯)酶标抗体的准备,酶联免疫吸附实验条件的摸索等。(总结刊登在本所科学技术年刊上)同时,本人也总结整理为常规检定细则,应用于疫苗生产中残余牛血清含量的测定。此法为我所最早建立和应用的单位,也接受了所内外的来人学习。
5.微量蛋白质含量测定方法的摸索,近年来新制品很多,蛋白质含量又是其质量指标的关键,现有的经典凱氏定氮等方法已不能满足快速,微量的要求。所以,我们对乙肝疫苗,出血热试制疫苗等,进行了Lowzy法,TCA-Lowzy法及TCA-Kjeloth法检测蛋白质含量的比较,特别对成品采用TCA-Lowzy法进行检测时不同溶解温度进行了实验,基本建立了TCA-Lowzy测乙肝疫苗成品的蛋白含量,为生产和质量控制提供了方法和数据。(现已总结在乙肝生产总结和会议资料上)同时建立此法也接受了兄弟所来学习。
6.常规检定工作:
a.冻干血浆生产献血员筛选的血液化验工作,能及时完成任务,并能查阅资料结合外单位方法,总结整理了当时最快速的血液化验细则,为此项工作提供了方法和资料。同时给血站人员进行有关检验方面的讲课。
b.冻干制品残余水分含量的测定工作量比较大,试剂均由自己配制,能够解决出现的问题,多年检定结果证明制品此项合格率99%以上,对封口前,中,后三阶段试验有差异,但合格制品对此差异无关紧要。
c.参加了乙肝疫苗,出血热疫苗,百日咳组分菌苗试制工作的生化检定工作。对麻疹,乙脑,狂犬疫苗生产中残余牛血清含量的检定对于质量控制起到了监督作用。
d.在工作中,结合实验查阅了大量资料,其中有两篇刊登在本所译刊上,另外还翻译了Beckmon CDS-200型密度计说明书,ORION 1020型钾钠分析仪说明书近5千多字。
e.参加了所办三次生物制品班及兰大免疫学技术的讲课工作,其中自编教材及授课,能圆满完成任务受到好评。
刊登在微生物学免疫学译刊的两篇译文:
“用酶联免疫吸附法测定白喉毒素的抗体”1980.第三期
“蛋白A酶免疫分析法用于筛选杂交瘤的发展”1982.第四期
 
                    本人签名:吕桂荣         1987年7月4日
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老伴的干部履历表 2012-12-17T12:37:45 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://13077759 我在收拾老伴遗物的时候,发现了老伴亲手书写的两份资料,一份是干部履历表,一份是专业技术职务任职资格申请表。字如其人,看见老伴亲自书写的工整秀丽的文字又勾起了我对老伴的思念深情。也是老伴的生前生活轨迹真实纪录。
履历表是我和老伴结婚前老伴填写的资料,申请表是我们结婚后老伴填写的资料。
中共中央组织部 兰州生物制品研究所
干部履历表
(本表是摘要,无关的内容我已经去除。)
现名:吕桂荣
性别:女
出生年月:1941年8月
家庭出身:工人
本人成分:学生
籍贯:山东省章丘县
民族:汉
原有文化程度:大学
身体健康状态:良好
何时何地何人接受入团,入党,何时转正:
1960年6月于吉林铁中由李喜兰,孙海涛两同志介绍参加共青团。
何时何地怎样参加工作:
1965年9月由国家统一分配来兰州生物制品研究所工作。
土改前后家庭经济状况:
解放前后均依靠父亲工资维持生活。
家庭主要成员的姓名,职业和政治态度:
父亲:吕秉鸿 工人 哥哥:吕振殿 工人 嫂嫂:朱淑清 工人
国内外主要社会关系,他们的政治态度和职业,过去和现在的关系如何:
国内:
吕桂兰:(姐姐)工人 群众 关系密切。
刘金良:(姐夫)工人 党员 关系密切。
荣吕氏:(大姑)家务 群众 关系密切。
吕秉顺:(叔父)工人 群众 关系一般。
王吕氏:(二姑)家务 群众 关系一般。
王兆富:(二姑父)工人 群众 关系一般。
国外:无
家庭成员和主要社会关系中有无被杀,关,管,斗的,与本人的关系如何:
何时何地参加过何种民主党派和进步团体,现在是否民主党派成员,担任何种工作:
何时何地参加过何种反动党团,道会门及其他反动组织,担任过何职,有何活动:
何时何地被捕,被俘过,经过情形及表现如何:
何时何地脱过党,失掉过关系,经过情形如何,以后是怎样解决的:
何时何地经过何部门审查,结论如何:
何时何地何原因受过何种奖励或处分:
有何专长,懂得何种外国语文,熟练程度如何:
参加革命前后履历
年 月 至 年 月         在何地区何部门      任何职   证明人
1949年3月至1950年8月   长春市长通路小学       学生  荣淑清
1950年8月至1951年10月   吉林市吉林铁小        学生  苏玉芬
1951年10月至1954年9月   通化市通化铁小        学生  李永财
1954年9月至1957年9月    大栗子铁中            学生  窦淑筠
1957年9月至1960年7月    吉林铁中              学生  窦淑筠
1960年8月至1965年8月    长春市吉林大学        学生  窦淑筠
1965年9月至               兰州市兰州生物制品研究所
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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr Default Cloumn 我在收拾老伴遗物的时候,发现了老伴亲手书写的两份资料,一份是干部履历表,一份是专业技术职务任职资格申请表。字如其人,看见老伴亲自书写的工整秀丽的文字又勾起了我对老伴的思念深情。也是老伴的生前生活轨迹真实纪录。
履历表是我和老伴结婚前老伴填写的资料,申请表是我们结婚后老伴填写的资料。
中共中央组织部 兰州生物制品研究所
干部履历表
(本表是摘要,无关的内容我已经去除。)
现名:吕桂荣
性别:女
出生年月:1941年8月
家庭出身:工人
本人成分:学生
籍贯:山东省章丘县
民族:汉
原有文化程度:大学
身体健康状态:良好
何时何地何人接受入团,入党,何时转正:
1960年6月于吉林铁中由李喜兰,孙海涛两同志介绍参加共青团。
何时何地怎样参加工作:
1965年9月由国家统一分配来兰州生物制品研究所工作。
土改前后家庭经济状况:
解放前后均依靠父亲工资维持生活。
家庭主要成员的姓名,职业和政治态度:
父亲:吕秉鸿 工人 哥哥:吕振殿 工人 嫂嫂:朱淑清 工人
国内外主要社会关系,他们的政治态度和职业,过去和现在的关系如何:
国内:
吕桂兰:(姐姐)工人 群众 关系密切。
刘金良:(姐夫)工人 党员 关系密切。
荣吕氏:(大姑)家务 群众 关系密切。
吕秉顺:(叔父)工人 群众 关系一般。
王吕氏:(二姑)家务 群众 关系一般。
王兆富:(二姑父)工人 群众 关系一般。
国外:无
家庭成员和主要社会关系中有无被杀,关,管,斗的,与本人的关系如何:
何时何地参加过何种民主党派和进步团体,现在是否民主党派成员,担任何种工作:
何时何地参加过何种反动党团,道会门及其他反动组织,担任过何职,有何活动:
何时何地被捕,被俘过,经过情形及表现如何:
何时何地脱过党,失掉过关系,经过情形如何,以后是怎样解决的:
何时何地经过何部门审查,结论如何:
何时何地何原因受过何种奖励或处分:
有何专长,懂得何种外国语文,熟练程度如何:
参加革命前后履历
年 月 至 年 月         在何地区何部门      任何职   证明人
1949年3月至1950年8月   长春市长通路小学       学生  荣淑清
1950年8月至1951年10月   吉林市吉林铁小        学生  苏玉芬
1951年10月至1954年9月   通化市通化铁小        学生  李永财
1954年9月至1957年9月    大栗子铁中            学生  窦淑筠
1957年9月至1960年7月    吉林铁中              学生  窦淑筠
1960年8月至1965年8月    长春市吉林大学        学生  窦淑筠
1965年9月至               兰州市兰州生物制品研究所
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感恩节——思念,感恩亲人! 2012-11-22T18:06:16 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://12895233 感恩节——思念,感恩亲人!
今天是美国感恩节,全家人聚在一起,吃火鸡,感谢上帝给我们粮食,感谢上天给我们吃喝,阿门!不知道,为什么在感恩节美国佬要吃火鸡,可能过去美国人生活很穷苦,平时难得吃肉,只有在每年的感恩节打牙祭吧?可怜倒霉的火鸡此时此刻的心情又是如何呢?
人不能独立于世界,需要互相搀扶,支持,后人在享受前人创造的幸福,人要懂得感恩,要知恩图报,所谓“滴水之恩当涌泉相报”就是这个意思。
我们感恩给我们盖房的农民工,我们感恩给我们粮食的农民,我们感恩给我们衣服的工人,我们感恩老师教授我们知识,我们感恩科学家带给我们现代生活,冰箱,电视,手机,汽车,网络,宽带,电脑,微波炉,电烤箱,数码相机,打印机……
当然,我们还要特别感恩我们的亲人,祖父母,父母,丈夫,妻子,兄弟姐妹,孩子,正是有了他们才有我们的幸福美满的和睦家庭,“家和万事兴”,有了家就像鸟儿有了窝,在家里,女人是天堂,贤妻良母,相夫教子,男人是顶梁柱,是到处“折腾”的钱耙子,女人是钱匣子,人的一生都是在“摸着石头过河”,不断地“折腾”,无数次地“得失”,无数次的顺利和挫折,无数次的成功和失败,无数次的生死较量。
一个人,一个家庭,一个民族,一个国家,一个政党亦然。
“中华民族到了最危险的时候,我们万众一心冒着敌人的炮火,前进!”义勇军进行曲在耳边回响!
现在,我们有了安定,平稳,和谐的好日子,我们在心里更应该感恩我们的党,我们的祖国,我们的民族,我们的先烈,是他们经受了无数次生死存亡的奋斗,无数次的流血牺牲,才换取了我们今天的幸福生活。
我感恩老伴给了我一个幸福的家,感恩老伴给了我们漂亮,活泼的儿女,感恩老伴培育儿女健康成长,成家立业。
我感恩苍天,我虽然在半个世纪之前就已有致命的核放射污染,可我今天还依然活存,既然上帝不要我,阎王爷也不要我,那我就继续活下去吧。
我愿意用我自己的生命去延续老伴的寿命,可老伴依然固执地离开我先行为我探路天堂,那里一定是非常幸福,快乐,浪漫,那里一定是没有战争,没有杀戮,没有剥削,没有压迫,没有饥饿,没有污染的香格里拉美丽净土,老伴一定是在那里为我执着守候爱情,呵护亲情,相思白头。
老伴一定在天堂祈祷,祝福,保佑我们全家人平安吉祥,幸福美满,快乐和谐,永远永远“扎西德勒”!
现在,我感恩网络,“纪念馆”连接了天上人间,让我能每天和老伴相伴,倾述,交流,分享。
有人说故去的亲人“入土为安”,花巨资购买墓地,定期祭拜。而我老伴的“纪念馆”每天香火旺盛,不到一年就有一万五千多亲人拜祭,我为老伴谱写的祭文已有六十多篇,我每天去看望老伴,就像老伴没有离去一样,她永远和我们全家在一起!我心里非常踏实,老伴虽然离开我有十个月啦,时间飞快地消逝,老伴仍然和我一起生活,一起睡觉,起床,吃饭,上电脑,一起翻译文章,一起漫游地球村!
我感恩网络让我每天漫游地球村,去“译言网”和网友见面,汲取别人翻译新知,发表自己的翻译文章与大家快乐共享。
我感恩这个世界,感恩所有的亲朋好友,特别感恩我的老伴,我的儿女,我的所有亲人!
老伴,你好
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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr Default Cloumn 感恩节——思念,感恩亲人!
今天是美国感恩节,全家人聚在一起,吃火鸡,感谢上帝给我们粮食,感谢上天给我们吃喝,阿门!不知道,为什么在感恩节美国佬要吃火鸡,可能过去美国人生活很穷苦,平时难得吃肉,只有在每年的感恩节打牙祭吧?可怜倒霉的火鸡此时此刻的心情又是如何呢?
人不能独立于世界,需要互相搀扶,支持,后人在享受前人创造的幸福,人要懂得感恩,要知恩图报,所谓“滴水之恩当涌泉相报”就是这个意思。
我们感恩给我们盖房的农民工,我们感恩给我们粮食的农民,我们感恩给我们衣服的工人,我们感恩老师教授我们知识,我们感恩科学家带给我们现代生活,冰箱,电视,手机,汽车,网络,宽带,电脑,微波炉,电烤箱,数码相机,打印机……
当然,我们还要特别感恩我们的亲人,祖父母,父母,丈夫,妻子,兄弟姐妹,孩子,正是有了他们才有我们的幸福美满的和睦家庭,“家和万事兴”,有了家就像鸟儿有了窝,在家里,女人是天堂,贤妻良母,相夫教子,男人是顶梁柱,是到处“折腾”的钱耙子,女人是钱匣子,人的一生都是在“摸着石头过河”,不断地“折腾”,无数次地“得失”,无数次的顺利和挫折,无数次的成功和失败,无数次的生死较量。
一个人,一个家庭,一个民族,一个国家,一个政党亦然。
“中华民族到了最危险的时候,我们万众一心冒着敌人的炮火,前进!”义勇军进行曲在耳边回响!
现在,我们有了安定,平稳,和谐的好日子,我们在心里更应该感恩我们的党,我们的祖国,我们的民族,我们的先烈,是他们经受了无数次生死存亡的奋斗,无数次的流血牺牲,才换取了我们今天的幸福生活。
我感恩老伴给了我一个幸福的家,感恩老伴给了我们漂亮,活泼的儿女,感恩老伴培育儿女健康成长,成家立业。
我感恩苍天,我虽然在半个世纪之前就已有致命的核放射污染,可我今天还依然活存,既然上帝不要我,阎王爷也不要我,那我就继续活下去吧。
我愿意用我自己的生命去延续老伴的寿命,可老伴依然固执地离开我先行为我探路天堂,那里一定是非常幸福,快乐,浪漫,那里一定是没有战争,没有杀戮,没有剥削,没有压迫,没有饥饿,没有污染的香格里拉美丽净土,老伴一定是在那里为我执着守候爱情,呵护亲情,相思白头。
老伴一定在天堂祈祷,祝福,保佑我们全家人平安吉祥,幸福美满,快乐和谐,永远永远“扎西德勒”!
现在,我感恩网络,“纪念馆”连接了天上人间,让我能每天和老伴相伴,倾述,交流,分享。
有人说故去的亲人“入土为安”,花巨资购买墓地,定期祭拜。而我老伴的“纪念馆”每天香火旺盛,不到一年就有一万五千多亲人拜祭,我为老伴谱写的祭文已有六十多篇,我每天去看望老伴,就像老伴没有离去一样,她永远和我们全家在一起!我心里非常踏实,老伴虽然离开我有十个月啦,时间飞快地消逝,老伴仍然和我一起生活,一起睡觉,起床,吃饭,上电脑,一起翻译文章,一起漫游地球村!
我感恩网络让我每天漫游地球村,去“译言网”和网友见面,汲取别人翻译新知,发表自己的翻译文章与大家快乐共享。
我感恩这个世界,感恩所有的亲朋好友,特别感恩我的老伴,我的儿女,我的所有亲人!
老伴,你好
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感恩万圣节 2012-11-01T22:24:34 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://12719070 感恩万圣节
中元节过后老人节,现在又是西方万圣节。
西方鬼节,是每年的11月1日,西方和日本万圣节有化妆大游行,特别是那些“扮鬼”孩子的表演,非常热闹。
万圣节前夜美国世界末日来临飓风“桑迪”肆虐。
昨天晚上是万圣节前夜,我梦见老伴了,她睡觉说冷,我准备给她盖毛毯,我却从梦境中醒来,天上人间,没人陪伴,我们都感觉冷漠无助了,我们现在都是空巢独居老人了。感恩西方万圣节让我真的和老伴在梦幻中相见了。
老伴和我分别后,她一直是我心中的牵挂,我只能每天上网去老伴的纪念馆拜祭她,以寄托我对她的思念。这对我也是个慰藉。
我的精力和体力都逐渐衰退,现在每周星期六和星期天全天带孙子,星期一女儿回家和我互相陪伴,做饭,晚上儿子,儿媳和孙子也回家团聚吃饭。另外还要有几次接替儿子接孙子,他们工作忙,顾不上。这样,一周下来,我几乎没有多少自己活动的时间了。
我在网上的翻译文章,就基本上没有多少精力去打理去专心翻译了,心有余而力不足了。毕竟我是七十三岁的古稀老人了,曾经有过的拼搏和“传奇”都变成了过去,成为梦境,我不会再现往日的“拼命三郎”的干劲了。
过去我无论做什么,心中总是有个目标,是为了老婆为了孩子,可现在我连生活的目标都没了。
20-30岁我为“国家命运”,为民族的命运,为原子弹氢弹奉献了青春;30-73岁我为医学生物事业,为老婆孩子奉献了所有的精力和体力。半个多世纪的灵与肉的碰撞,我比常人付出多得多的努力,拼搏,奋斗,学习,挣扎;我长期与射线病与死神抗争博弈;我在文化大革命浩劫中“逆水行舟”拼命学习英语,数十年下来,我几乎是3个月翻译一本医学生物专业英文书籍的速度,翻译了50多本书,退休之后,我更勤奋了,更努力了。
后来,有了房子,孩子长大了,又有了孙子,眼看着生活一天天好起来,我有两个“孩子”,一个是老伴是“老小孩”,一个是我们的孙子是“小小孩”,我和患老年痴呆症,糖尿病,高血压,脑梗塞老伴,天真活泼的小孙子相依为命,其乐融融,不料,“七十三八十四,阎王不叫自己去”,老伴真的没有迈过这个生命的“坎”,老伴竟先我而去,抛下我孤独一人,现在,我不得不承认我是老了。
以后的日子怎么过?没有老伴的日子怎么过!?
过去我躺在老伴身旁,马上就睡着了,都不用翻身,可现在,晚上12点上床,辗转难眠,思绪万千,就是睡不着觉,我现在是尝够了失眠的味道和痛苦。
我辛苦了一辈子,奋斗了一辈子,现在,我还能自理,如果我哪一天,突然不能自理了,到那时,我该怎么办?
过去,我从来不想这些,但现在,因为年龄的关系,这活生生的现实就要摆在我的面前了,我能不考虑吗?身边和周期的亲朋好友一个个活蹦乱跳说走就走了。
活一天算一天吧,到时候再说!
对孩子我能帮助多少就尽多少力吧,人不就是为孩子活吗,要不然,怎么说“可怜天下父母心”哪。
可有许多老年人认为自己一辈子苦受了,罪遭了,到晚年应该为自己痛痛快快地活一把了,活的确实非常潇洒,不顾子女,自己尽情吃喝玩乐,搓麻跳舞,洗桑拿吃西餐,住宾馆,约几个好友一起旅行,云游四海,周游列国,甚至想逛遍世界。
这些老年人的确是“夕阳红”了,想得美,看得开,做得到,无可非议,让人羡慕。可我确实做不到,想,但不能。

   有人嘲笑我,说我是傻子,不会生活,我就铁了心,在我离开这个地球之前,我心甘情愿为亲情为家庭做傻子,为子孙当牛做马,无怨无悔,做我想做,做我能做的事情,我想,远在天堂的老伴也会高兴的欢笑,拍手,天上人间心相通情相系,齐心又协力,鼓励我不遗余力,死而后已,为我们的子孙后代继续代她多做奉献

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liuyr http://www.bokee.net/blogmodule/weblogcomment_index.do?bokeeName=liuyr 生活 感恩万圣节
中元节过后老人节,现在又是西方万圣节。
西方鬼节,是每年的11月1日,西方和日本万圣节有化妆大游行,特别是那些“扮鬼”孩子的表演,非常热闹。
万圣节前夜美国世界末日来临飓风“桑迪”肆虐。
昨天晚上是万圣节前夜,我梦见老伴了,她睡觉说冷,我准备给她盖毛毯,我却从梦境中醒来,天上人间,没人陪伴,我们都感觉冷漠无助了,我们现在都是空巢独居老人了。感恩西方万圣节让我真的和老伴在梦幻中相见了。
老伴和我分别后,她一直是我心中的牵挂,我只能每天上网去老伴的纪念馆拜祭她,以寄托我对她的思念。这对我也是个慰藉。
我的精力和体力都逐渐衰退,现在每周星期六和星期天全天带孙子,星期一女儿回家和我互相陪伴,做饭,晚上儿子,儿媳和孙子也回家团聚吃饭。另外还要有几次接替儿子接孙子,他们工作忙,顾不上。这样,一周下来,我几乎没有多少自己活动的时间了。
我在网上的翻译文章,就基本上没有多少精力去打理去专心翻译了,心有余而力不足了。毕竟我是七十三岁的古稀老人了,曾经有过的拼搏和“传奇”都变成了过去,成为梦境,我不会再现往日的“拼命三郎”的干劲了。
过去我无论做什么,心中总是有个目标,是为了老婆为了孩子,可现在我连生活的目标都没了。
20-30岁我为“国家命运”,为民族的命运,为原子弹氢弹奉献了青春;30-73岁我为医学生物事业,为老婆孩子奉献了所有的精力和体力。半个多世纪的灵与肉的碰撞,我比常人付出多得多的努力,拼搏,奋斗,学习,挣扎;我长期与射线病与死神抗争博弈;我在文化大革命浩劫中“逆水行舟”拼命学习英语,数十年下来,我几乎是3个月翻译一本医学生物专业英文书籍的速度,翻译了50多本书,退休之后,我更勤奋了,更努力了。
后来,有了房子,孩子长大了,又有了孙子,眼看着生活一天天好起来,我有两个“孩子”,一个是老伴是“老小孩”,一个是我们的孙子是“小小孩”,我和患老年痴呆症,糖尿病,高血压,脑梗塞老伴,天真活泼的小孙子相依为命,其乐融融,不料,“七十三八十四,阎王不叫自己去”,老伴真的没有迈过这个生命的“坎”,老伴竟先我而去,抛下我孤独一人,现在,我不得不承认我是老了。
以后的日子怎么过?没有老伴的日子怎么过!?
过去我躺在老伴身旁,马上就睡着了,都不用翻身,可现在,晚上12点上床,辗转难眠,思绪万千,就是睡不着觉,我现在是尝够了失眠的味道和痛苦。
我辛苦了一辈子,奋斗了一辈子,现在,我还能自理,如果我哪一天,突然不能自理了,到那时,我该怎么办?
过去,我从来不想这些,但现在,因为年龄的关系,这活生生的现实就要摆在我的面前了,我能不考虑吗?身边和周期的亲朋好友一个个活蹦乱跳说走就走了。
活一天算一天吧,到时候再说!
对孩子我能帮助多少就尽多少力吧,人不就是为孩子活吗,要不然,怎么说“可怜天下父母心”哪。
可有许多老年人认为自己一辈子苦受了,罪遭了,到晚年应该为自己痛痛快快地活一把了,活的确实非常潇洒,不顾子女,自己尽情吃喝玩乐,搓麻跳舞,洗桑拿吃西餐,住宾馆,约几个好友一起旅行,云游四海,周游列国,甚至想逛遍世界。
这些老年人的确是“夕阳红”了,想得美,看得开,做得到,无可非议,让人羡慕。可我确实做不到,想,但不能。

   有人嘲笑我,说我是傻子,不会生活,我就铁了心,在我离开这个地球之前,我心甘情愿为亲情为家庭做傻子,为子孙当牛做马,无怨无悔,做我想做,做我能做的事情,我想,远在天堂的老伴也会高兴的欢笑,拍手,天上人间心相通情相系,齐心又协力,鼓励我不遗余力,死而后已,为我们的子孙后代继续代她多做奉献

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三八节祭文(细菌纤维素) 2012-03-06T16:39:58 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://10426239 老白龙马留言:
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细菌纤维素
作者:Stanislaw Bielecki
20051
 
目录
摘要
1.前言
2.历史概述
3.细菌纤维素结构
4.化学分析和测定
5.产生菌
6.生理功能
7.细菌纤维素的生物合成
8.细菌纤维素的生物降解
9.生物技术生产
10.特性
11.应用
12.专利
13.展望和远景
参考
缩写
主题
 
1.前言
2.历史概述
3.细菌纤维素的结构
4.化学分析和测定
5产生菌
6.生理功能
7.细菌纤维素生物合成
7.1.纤维素前体合成
7.2.纤维素合成酶
7.3.生物合成机制
7.4.纤维素生物合成的基因基础
7.5.细菌纤维素合成控制
7.6.由A. xylinum的可溶多糖合成
7.7.由A. xylinum合成的细胞内和细胞外纤维素的作用
8.细菌纤维素的生物降解
9.生物技术生产
9.1.天然源分离和细菌纤维素产生菌株改进
9.2.发酵生产
9.3.体外生物合成
9.4.化学—酶合成
9.5.预期在未来应用的生产工艺
9.6.回收和提纯
10.特性
11.应用
11.1.科技应用
11.2.医学应用
11.3.食品应用
11.4.其它应用
12.专利
13.展望和前景
 
 
1.前言
纤维素是地球上最丰富的生物聚合物,公认是植物界的主要成分,但也代表微生物细胞外聚合物。细菌纤维素(BC)属于基础代谢的特殊产物并且是一种保护包被,而植物纤维素(PC)起着结构作用。
由细菌合成的纤维素是属于醋酸菌属(Acetobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和八叠球菌属(Sarcina(Jonas and Farah, 1998)。最有效的生产菌是革兰氏阴性、醋酸菌Acetobacter xylinum(重新分类为Gluconacetobacter xylinus, Yamada et al., 1997; Yamada, 2000),用于微生物基础和纤维素研究(Cannon and Anderson, 1991)
研究集中在生物聚合物合成机制及决定它实际应用的机构和特性(Legge, 1990; Ross et al., 1991)。细菌纤维素最重要特性之一是它的化学纯度,是它与通常伴有去除特别困难半纤维素和木质素的植物纤维素的区别。
因为这独特性质,是从超细网状结构产生的,因此,细菌纤维素发现在造纸、纺织品和食品工业以及在化妆品和医药中的生物材料的诸多应用(Ring et al., 1986)。这种多糖的广泛应用显然是根据生产规模及其价值决定的。因此,基础研究和菌株改良和生产工艺开发加强研究同时进行。
 
2.历史概述
1886年由A. J. Brown首次报道A. xylinum细胞外胶膜合成,细菌纤维素在20世纪后半期引起更大关注。Hestrin 等人(1947, 1954)开始应用A. xylinum作为模型菌集中研究细菌纤维素合成,证明休眠和冻干醋酸菌细胞在有葡萄糖和氧存在可以合成纤维素。随后Colvin (1957)在含无A. xylinum细胞提取物、葡萄糖和ATP的样品测到纤维素合成。在细菌纤维素合成研究的里程碑,在这评论中提出,不仅是细菌聚合物的生物起源,而且还有对植物所做的贡献,导致了在自然界最重要进程之一的了解。
真实的历史概述提出贯穿下面所有章节,包括参考。
 
3.细菌纤维素结构
在细菌纤维素广泛研究,细菌纤维素的化学性与植物纤维素一致,揭示纤维素是β—1,4无支链聚合物连接吡喃葡萄糖残余,但它的大分子结构和特性与后者不同(图1)细菌纤维素初生链聚集形成亚原纤维,宽约1.5 nm和薄的自然发生的纤维,只相当于某些植物形成层中和奎宁粘液中检测到的纤维素次级纤维。细菌纤维素亚纤维被结晶进入微纤维(Jonas Farah, 1998)。这些成束和之后成带(Yamanaka et al., 2000)。按Zaar (1977)带的大小是3–4 ()×70–80 nm (),Brown et al. (1976)3.2×133 nm,或按Yamanaka 等人. (2000),4.1×117 nm,而桦树或松树桨产生纤维素纤维宽度是两个数量级2–2和各为3.0–7.5×10 mm,微生物超细丝带更大1.4–4.0×10纤维素,它的长的范围1 to 9 µm,形成一
稠密网状结构(Figure 2),结合大量的氢来稳定(Figure 3)。细菌纤维素与它的培养对应物也有区别,在高结晶指数(60%以上)和不同的聚合程度,通常在2000 6000之间,(Jonas and Farah, 1998),但在某些情况甚至可达到16,000 20,000之间 (Watanabe et al., 1998b),而培养聚合物的平均聚合程度变化从13,000 t14,000 (Teeri, 1997)
 
1.植物纤维素“边饰微粒”纤维与细菌纤维素微纤维比较模式图(Iguchi et al., 2000; with kind permission)
2.静止培养A. xylinum得到的细菌纤维素膜扫描电子显微镜图像(a)和附着在纤维素带的细菌细胞(b
3.在纤维素中链外(a)和链内(b)氢键。
A. xylinum
细菌纤维素肉眼形态完全根据培养条件而定(Watanabe et al., 1998a;Yamanaka et al., 2000)。在静止条件下(图4)细菌积聚纤维素膜(S-BC)出现在营养培养基表面,是在氧气丰富的气液界面。纤维素亚纤维,在细菌细胞表面从直线序孔连续伸出、结晶成微纤维并强行深入生长培养基中。因此,皮革样薄膜供养A. xylinum细胞群,由重叠和绞合纤维素带组成,形成平行有秩平面(Jonas and Farah, 1998)
静止培养细菌纤维素临近索支和互相连接比搅拌培养产生的细菌纤维素更少、在一型不规律颗粒、星形和纤维索、在培养基中很好分散(图5(Vandamme et al., 1998)。在搅拌细菌纤维素网状索相互连接形成网格模式,并有粗略垂直和粗略平行定位(Vandamme et al., 1998)
4.在静止培养中形成的细菌纤维素膜。
5.在搅拌培养中形成的细菌纤维素小球。
搅拌纤维素和静止纤维素在三维结构之差异在扫描电子显微镜显而易见。静止纤维素纤维有更大扩展和一个交叉堆积在另一个上面。搅拌纤维素索被缠绕和弯曲(Johnson and Neogi, 1989)
此外,它们有更大横截面比静止纤维素纤维宽(0.1–0.2 µm)(通常是0.05–0.10 µm)。静止纤维素和搅拌纤维素之间的形态差异致使结晶度数不同、不同晶粒大小和纤维素I容量。
纤维素有两种常见结晶型,定为I II,由X光、核磁共振(NMR)、拉曼光谱和红外线分析来区别(Johnson Neogi, 1989)。已知在相对稳定纤维素I,多是由植物也可以由静止培养的A. xylinum合成,平行β-1,4-葡聚糖链是单向排列,而纤维素IIβ-1,4-葡聚糖链排列随意方式。它们多是反平行的并有大量氢键链接,这结果是使纤维素II有更高热稳定性。
搅拌细菌纤维素比静止细菌纤维素有更低结晶度指数和结晶更小(Watanabe et al.,1998a)。还注意到,在搅拌培养中合成的细菌纤维素发生大部分是纤维素II。在自然界,纤维素II只有几种生物合成(某些海藻、霉菌和细菌,像胃八叠球菌(Sarcina ventriculi))(Jonas and Farah, 1998);这种纤维素的工业生产是根据植物纤维素化学转换。
C-NMR(核磁共振)有可能揭示纤维素I的存在和I的两个独特的纤维素型(Watanabe et al., 1998a)。这些型发生在海藻、细菌和植物衍生的纤维素中。后者比细菌纤维素含有更少纤维素I(Johnson and Neogi, 1989)
纤维素I不可逆晶体转变到I改变X线和CP/MASC-NMR(核磁共振)光谱是因为在单元细胞中的差异。静止细菌纤维素比搅拌细菌纤维素含有更多纤维素I。已报道在搅拌细菌纤维素和静止细菌纤维素之间纤维素I的差异超过结晶度指数(Watanabe et al., 1998a),和大部分纤维素I是与晶体大小密切相关。
 
4.化学分析和测定
为了测定纤维素的结晶或非晶态,有几种直接染色用于线状β-1,4-葡聚糖是特异性的(Mondal and Kai, 2000)。都是荧光增白剂并形成色素-纤维素复合物,由范德华和/或氢键合来稳定。
这些染料之一是荧光增白剂卡尔科弗卢尔(Calcofluor)。这种直接染料不仅能使纤维素链可视,而且还能广泛用于初生纤维素链联合和结晶化研究(见章节7.3.2)
纤维素平均重量DPDP分布是用硝化纤维素样品通过高性能凝胶渗透来测定的(Watanabe et al., 1998a)
在搅拌培养条件下产生的微生物纤维素的网状结构和在静止培养形成的纤维素膜有条理分层结构之间的区别,在扫描电子显微镜图像显而易见(Johnson and Neogi, 1989)
为了区分来自纤维素II反平行之一的纤维素I平行链结晶格,可应用X线衍射、拉曼光谱、红外线分析和核磁共振(Johnson and Neogi, 1989)。结晶度指数和结晶大小是根据X线衍射测量值来计算的(Watanabe et al., 1998a)。纤维素I有两个独特型,即纤维素IIX线衍射不能区分、因此CP/MAS核磁共振分析,在冻干纤维素样品进行,对这大量组分进行判断(Watanabe et al., 1998a)
纤维素的理化特性像容水能力、分解纤维素悬液的粘度和干膜Young's系数是应用常规方法测定的(Watanabe et al., 1998a, Iguchi et al., 2000)
 
5.产生菌
细菌纤维素是由几个菌属合成的,其中醋酸菌株(Acetobacter)最著名。纤维素生产菌概述见表1. (Jonas and Farah, 1998)。聚合物的结构是根据微生物而定的,虽然它的生物合成路径和它的调节机制在大部分细菌纤维素产生细菌可能是共同的(Ross et al., 1991;Jonas and Farah, 1998)
Table 1. BC producers (Jonas and Farah, 1998, modified)
GenusCellulose structure
Acetobacte rextracellular pellicle composed of ribbons
Achromobacter fibrils
1.细菌纤维素产生菌(Jonas and Farah, 1998, modified)
菌属                纤维素结构
醋酸菌属(Acetobacte          胞外丝带组成薄膜
无色菌属(Achromobacter      原纤维
气杆菌属(Aerobacter          原纤维
土壤杆菌属(Agrobacterium     短小纤维
产碱杆菌属(Alcaligenes        原纤维
假单胞菌属(Pseudomonas      不明显小纤维
根瘤菌属(Rhizobium           短小纤维
八叠球菌属(Sarcina            无定型纤维素
动胶菌属(Zoogloea            尚未确定
A. xylinum(同义词A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus),是纤维素最有效产生菌,近来重新分类并包括在新奇菌属葡糖酸醋酸菌属(Gluconacetobacter)中,木葡萄酸醋杆菌(G. xylinus(Yamada et al., 1998, 2000)和某些其它菌属((G. hansenii, ropaeus, G. oboediens, and G. intermedius).)一起。
 
6.生理功能
在自然栖息地,大部分细菌合成胞外多糖,在细胞周围形成包封(Costeron,1999)。细菌纤维素就是这样物质的一个例子。纤维素产生菌的细胞包封在聚合物网络之中,常常在液-气界面维持群聚(Wiliams and Cannon, 1989)。因此,细菌纤维素形成菌株能栖息在污水中(Jonas and Farah, 1998)。聚合物基质使部分细胞粘附于任何可接近的表面并促使营养提供,因为它们在聚合物格架中浓集,与周围水环境相比,由于它的吸附特性而明显增强(Jonas and Farah, 1998; Costeron, 1999)。某些作者设想,由A. xylinum合成的纤维素也可以起储存作用并能被饥饿微生物利用。它的分解是由外和内葡聚糖酶催化的,这种联合存在,在某些产生纤维素A. xylinum菌株的培养基中被检测到(Okamoto et al., 1994)
因为纤维素层的粘度和亲水特性,使产生的细菌在栖息地对不利变化(水容量减少、pH变化、毒性物质、病原微生物的存在、等)抵抗增强,并且它们在包膜内能进一步生长和发育。还发现细菌周围的纤维素使它们对紫外光的照射得以保护。在紫外光照射1小时处理,还有多达23%的醋酸菌细胞因为受细菌纤维素包裹而活存。如果去除保护多糖将使它们的活性急剧降低(只有3%(Ross
et al., 1991)
 
7.细菌纤维素的生物合成
细菌纤维素的合成是精确和特异控制的多-步骤过程,涉及大量独特的酶和催化及调控蛋白复合物,其超分子结构迄今尚未明确界定。这些过程包括尿苷二磷酸葡萄糖(UDPGlc)合成,这是纤维素的前体,随后是葡萄糖聚合成β-1,4-葡聚糖链,和这初生链联合特征的带样结构,由数百或数千个别纤维素链构成。
UDPGlc合成的路径和机制已明确了解,而葡萄糖聚合成大的和无支链、它从细胞内挤出及自行组装成原纤维的分子机制,需要进一步阐述。
而且,细菌纤维素合成研究会有助于更好了解植物纤维素的生物起源。
7.1.纤维素前体的合成
A. xylinum的纤维素合成是碳代谢的最终产物,取决于细胞介入戊糖磷酸盐循环或克雷布斯循环的生理状态、与糖异生耦合(6) (Ross et al., 1991; Tonouchi et al., 1996)糖酵解在醋酸菌不起作用,因为它们磷酸果糖激酶路径不能合成这重要酶(EC 2.7.1.56) (Ross et al., 1991)。在A. xylinum纤维素合成是与氧化分解过程密切相关并消耗异化反应衍生的多达10%能量(Weinhouse, 1977)。细菌纤维素产生不受其它同化过程包括蛋白合成的干扰(Ross et al., 1991)
6.A. xylinum碳代谢路径。CS,纤维素合成(EC2.4.2.12),FBP,果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.11)GK,葡糖激酶(EC 2.7.1.2); G6PDH,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49); 1PFK,果糖-1-磷酸盐激酶(EC 2.7.1.56); PGI,磷酸葡萄糖异构酶;PMG, UDPGlc磷酸葡萄糖变位酶(EC 5.3.1.9); PTS,磷酸转移酶系统;UGP,焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9); Fru-bi-P,果糖-1,6--磷酸盐;Fru-6-P,果糖-6-磷酸盐;Glc-6(1)-P,葡萄糖-6(1)-磷酸盐;PGA,磷酸葡糖酸;UDPGlc,尿苷二磷酸葡萄糖。
A. xylinum能转换各种碳化合物,如已糖、甘油、二羟基丙酮、丙酮酸和二羧酸成为纤维素,通常有效率50%。后面化合物进入克雷布斯循环并由于草酸盐脱羧成丙酮酸盐经过糖异生转换到已糖,与甘油、二羟基丙酮类似,并且是戊糖磷酸循环的间体(图6
纤维素直接前体是UDPGlc,是一种常规路径的产物,常见于包括植物的很多生物,并涉及葡萄糖磷酸化到葡萄糖-6-磷酸盐(Glc-6-P),由葡糖激酶催化,接之这间体向Glc-α-1-P,异构化,由磷酸葡糖酸变位酶催化并且后面代谢物由UDPGlc焦磷酸化酶转化到UDPGlc。这最后的酶似在纤维素合成中介入重要酶之一,因为某些表型纤维素阴性突变物(Cel),特别缺乏这种酶(Valla et al., 1989),虽然它们表现有纤维素合成(CS)活性,纤维素合成的观察方法经过体外证实,Cel株无细胞提取物来催化(Saxena et al., 1989)。此外,不同A. xylinum菌株之间焦磷酸化酶活性有变化并且在最有效纤维素产生菌测定有最高活性,如A. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001。这后者菌株喜欢果糖作碳源,磷酸葡萄糖异构酶表现高活性,并且具有依赖磷酸烯醇丙酮酸盐磷酸转移酶系统。这系统刺激果糖向果糖-1-磷酸盐转换并促进果糖-16-二磷酸盐(图6
7.2.纤维素合成酶
纤维素在植物和原核生物的生物合成是由尿苷二磷酸盐(UDP)-形成CS催化的,主要是处置4-β-糖基转移酶(EC 2.4.1.12, UDPGlc: 1,4-β-葡聚糖4-β-D-葡萄基转移酶),因为它从UDPGlc向新形成多糖链连续输送吡喃葡萄糖残余物并所有时间都与这链连接。低聚CS复合物常被叫作末端复合物(TCs)。它被假设,TCs首先负责β-1,4-葡聚糖链合成,通过外膜挤出(如果是球状,CS催化域是定位在细胞膜的胞浆侧),并联合和晶体化为明确的超分子结构,跟随头两个过程。
A. xylinum纤维素合成是典型膜-固定蛋白,分子量400–500 kDa (Lin and Brown, 1989),并于胞浆膜紧密结合。
因为这个定位,CS纯化是非常困难的并且膜组分的分离必须在CS溶解和纯化之前进行。
而且,A.xylinum CS表明是一种很不稳定的蛋白(Lin and Brown, 1989)。从膜分离CS是应用洋地黄皂甙(Lin and Brown, 1989)或是洗涤剂(Triton X-100)进行的并用胰蛋白酶处理(Saxena et al., 1989),接之在纤维素中截留CS
按照Lin and Brown (1989)所述,纯化CS制剂在三种不同型亚单位中含有,分子量在90, 67, and 54 kDaSaxena et al. (1989)发现只有两型多肽(83 and 93 kDa).。这后面结果似更可信,因为这两个亚单位大小与Saxena et al. (1990b, 1991)CS操纵子测定的两个基因cesA cesB的大小及由Wong et al. (1990) and Ben-Bassat et al. (1993)对同样操纵子(see Section 7.4).报道的基因bcsA bcsB是相符的。
光化学亲和研究指出83-kDa多肽是一种催化亚单位,显示有高亲和力倾向UDPGlc (Lin et al., 1990)。根据基因序列,它含有723氨基酸残基,多是疏水的。这亚单位可能合成蛋白原,含有单一序列,由24个氨基酸残基组成,在制造加工期间截断(Wong et al., 1990)。成熟蛋白是靠近多肽链的N-末端以跨膜螺旋方式在细胞膜固定的。蛋白含有5个以上跨膜螺旋线,能相互和与在细胞质中潜入球型区域组成的一大的催化位点相作用。
Brown and Saxena (2000)主张A. xylinum CS的催化亚单位以同样方式操作次系加工糖基转移酶,即它在纤维素催化配糖直接结合合成,在异头碳构型同时反转来协助,来自UDPGlcα-构型,对多糖β-构型是单体供体。催活天冬氨酸残基(D),和在许多加工糖基转移酶的球形碎片中发现短序列DXD QXXRW
(Saxena and Brown, 1997)。在A. xylinumCS测到同样运动。在许多配糖合酶这球形碎片有两个区域特征(即由两个区域AB组成)(Saxena et al., 1995)A区包括D残基,是催化作用的关键,和DXD运动,这可能是结合核苷-糖的底物。
BrownSaxena (2000)近来证实由A. xylinum CSUDPGlc结合中这运动的参与,研究应用位点定向诱变得到酶突变。迄今尚不清楚A. xylinum CS的球形碎片是由一个还是两个域组成,虽然这第二种可能性更大。然而,已知A. xylinum CS催化亚单位是糖基化的。糖基化的两个可能位点在其原发结构中发现,是根据基因排序推测的(Saxena et al., 1990a)
93-kDa多肽与催化亚单位紧密结合。它含有单一序列靠近它的N-终端和一个跨膜螺旋靠近C-终端。这螺旋能固定在细胞膜。多肽可能是一个调控亚单位,与CS活化剂-环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)相互作用(7.5)93-kDa多肽不与93-kDa亚单位抗体结合。但是,尚不清楚CS是不是只由两个亚单位组成,因为这低聚复合物有多种作用,即β-1,4-葡聚糖聚合作用,细胞外亚纤维挤出,及纤维素带自身组装和晶体化,由微纤维组成。因此,CS复合物可能包括在跨膜孔形成中涉及的其它多肽中。纯净CS显微镜图分析表明酶倾向形成四聚物或八聚物(Lin et al., 1989)
 
7.3.生物合成机制
亚稳定纤维素I同质异形的合成,在A. xylinum和其它纤维素-产生生物,包括植物,至少涉及两个中间步骤,即(1)葡萄糖分子向线形1,4-β-葡聚糖的聚合和(2)单一初始聚合链向超分子结构的组装和晶体化,每种纤维素-产生生物的特征。假设CS球域是定位在细胞膜细胞质一侧(see Section 7.2),还需要1,4-β-葡聚糖链通过膜转移到细胞外。所有这三个步骤是紧密相连的,并且聚合速率是受组装和晶体化速度限制的。
 
7.3.11,4-β-葡聚糖聚合机制
细菌纤维素的形成是在A. xylinum胞质膜通过CS复合物催化结成直线。因为这些复合物能聚合成200,000分子量的Glc s成为β-1,4-葡聚糖链(Ross et al., 1991),这过程必须是高强度运行的。这反应机制迄今尚未明确。最近,对在A. xylinum机制提出两个不同的假想。
其一,是在Brown实验室提出的(Brown, 1996; Brown and Saxena, 2000),假设1,4-β-葡聚糖聚合不涉及一脂间体,从UDPGlc把葡萄糖转移到新合成聚合物链。这假设与为无支链同多糖合成负责的糖基转移酶是加工酶的事实一致。1,4-β-葡聚糖聚合图示,由Brown及其同事提出,见图7
7。对聚合反应的一般概念导致β-1,4-葡聚糖链生物合成(Brown Saxena, 2000;
按这个模式,与其它加工糖基转移酶相似,CS催化亚单位的球形碎片中有3个催化位点。催化位点之一(2a),由DXD基序结合两个UDPGlc分子组成(见图7.1)第二个催化位点(1a),包括重要天冬氨酸(D)残基,在隐袋中催化形成两个Glc残基之间β-1,4-连接(见图7.2),伴随相关的两个UDP分子。第三个位点(3a),含有QXXRW基序,牵拉合成纤维二糖还原端(见图7.3)。二糖遗留区1a–2a,可以结合两个后续UDPGlc分子(见图7.4)并形成次级纤维二糖分子。接下来,涉及QXXRW基序,这第一个纤维二糖分子还原端,被迫向挤出位置。同时,次级纤维二糖分子与(位点1aD残基的协助)初始非还原端结合,得到纤维四糖。被清除的1a–2a区可以结合两个后续UDPGlc分子,去重复反应循环,在链上附着两个以上葡萄糖残基。这聚合作用模式简化表见图8
按这模式,新合成β-1,4-葡聚糖链开始形成它的还原端挤出。
8.Brown模型细菌纤维素生物合成简化表(Brown Saxena, 2000)。
Koyama等人(1997)研究证实了这模型。作者证明葡萄糖残基是附加于多糖非还原端的,初生聚合链还原端位置是远离细胞的。而且,在纤维素分子中两个邻近葡萄糖残基之间是扭曲角是180°,在生长链附加纤维二糖残基(而不是单一葡萄糖部分有助于维护)β-1,4-葡聚糖双重螺旋轴(Brown, 1996)。还有Kuga Brown (1988),应用银标记,证明纤维素从它的还原端开始链被挤出细胞外。
Han and Robyt (1998)应用A. xylinum ATCC 10821株研究了细菌纤维素合成(静止C跳动并与D-葡萄糖和细胞和膜制备追逐反应)应用UDPGlc,分别提出额外的,程序不同分子机制。他们认为活化的葡糖吡喃糖(来自UDPGlc)连贯残基被联接到生长纤维素链的还原端,因为得到从纤维素链挤出还原端的D-[C]葡糖醇与D-[C]葡糖醇的比率是随时间而减少的。Han Robyt假定脂焦磷酸盐和类萜特性是生物合成部分。按他们的观点,在细菌纤维素合成期间脂间体的形成由脉冲C标记和氯仿和甲醇混合物提取物多达33%来证实。它的定量提取是不可能的,因为当多糖链长超过8–10糖部分,含脂复合物在提取混合物中变得不能溶解。
Han Robyt提出,细菌纤维素生物合成在胞浆膜涉及三种酶嵌入:CS,焦磷酸脂:UDPGlc磷酸转移酶(LipPP:UDPGlc-PT),和焦磷酸脂磷酸水解酶(LPP)。其反应机制作者称为嵌入反应,在图9提出。
9。细菌纤维素合成机制涉及脂间体(Han and Robyt, 1998; )Lip、脂;P.磷酸;RibD-核糖;U,尿苷;葡糖残基;LP: UDPGPT,焦磷酸脂;CS;纤维素合成酶;LPP,焦磷酸脂磷酸水解酶。
这第一种酶从UDPGlc转移Glc-α-1-P到单磷酸酯(Lip-P),这样就得到焦磷酸脂-α-D-Glc (LipPP-α-Glc)(9反应1)。在端基碳α结构涉及Glc磷酸酯结合,与基底分子的残留相同。这反应的次级产物是UMP(按Brown氏模型UDP释放)。
接下来的反应(反应2,图9),由CS催化,葡萄糖残基从一LipPP-α-Glc分子转成另外一种和两个葡萄糖残基之间形成β-1,4-糖苷连接,由于它们之一C-4羟基组附着在次级葡萄糖(来自次级LipPP-α-GlcC-1羟基组。
在第三个反应(反应3,图9),在前步发生形成焦磷酸脂的水解和另外从UDPGlc得到的Glc-α-1P能附着于在这反应中释放的LipP。这3个反应循环连续得到一适宜长度β-1,4-葡聚糖链。这机制包括从一葡萄糖残基LipPP-α-Glc分子的端基碳结构转移从一LipPP-α-Glc分子到另外一种,或是到纤维二糖、丙糖、四糖,和随后到n-糖。一β-1,4-葡聚糖长链的受体,始终是单一α-D-葡萄糖残基,于聚合系统中存在的两个LipPP分子中的一个相连接。这意味着,来自位于远离细胞的初始纤维素链的还原端和非还原端的链发生延长,这与Brown模型是相矛盾的。按Han Robyt氏模型两者之间有两个协同LipPP分子和CS复合,不是处理糖基转移酶,是植入细菌的胞浆膜。
在纤维素生物合成中脂间体的参与从Agrobacterium tumensefaci(土壤杆菌)(Matthyse et al., 1995)、及Salmonella(沙门氏菌)O-抗原多糖(Bray and Robbins, 1967)Xanthomonas campestris黄单胞菌)胞胶(Ielpi et al.,
1981)得到证实。而且,这脂间体还涉及acetan的合成(DeLannino et al., 1988), 在许多A. xylinum菌株,这是一种与纤维素一起产生的可溶多糖(见7.6段)。为了阐明脂间体在纤维素形成中是否起作用已在深入研究,这是由Han Robyt (1998)提出的假设。相反,Brown氏设想(1996, 2000),由体外纤维素合成已证实,溶解的A. xylinum膜制剂用洋地黄皂苷催化(Linet al., 1985; Bureau Brown, 1987),和通过提纯CS亚单位合成聚合物(Lin Brown, 1989),不包括脂成分。
按照提出的两个假想细菌纤维素合成不需要任何原始物,与早时减免是相一致的(Canale-Parda and Wolfe, 1964)
7.3.2.纤维素链的组装和结晶
吡喃葡萄糖分子到β-1,4-葡聚糖的聚合,无论是什么机制,这是纤维素合成最复杂阶段,在细菌也是如此。纤维素独特的机构和特性,都是源于此。再导致深入阶段:就是链被挤出并在细胞外组装,得到超分子结构。在这些过程中最重要的是细菌纤维素的多聚复合物的特异结构,固定于细胞质膜。在A. xylinum细胞,这些复合物是沿着细胞长轴呈直线排列和一个细胞可容纳50–80植物细胞 (Brown et al., 1976),而在维管植物的组织细胞特征是6重对称花结(Brown and Saxena, 2000)
 
更多地充气,即在A. xylinum培养期间搅拌,或是加入某些物质,它不能渗入细胞内,但能与β-1,4-葡聚糖链竞争氢键(即羧甲基-CM-纤维素,荧光增白剂),能引起纤维素链超分子结构的明显改变,和替代带状聚合物,即相对稳定纤维素I(图10),原纤维与CS复合物同线并集成一行,第二,形成热力更稳定同质异形纤维素II
形成同质异形无定形纤维素II。这现象是组织细胞线性排列紊乱有关。Brown Saxena (2000)对这个问题的论述,这情况取决于最终产物的形态,在胞质膜组织细胞排列起一定作用,虽然他认为与某些藻类相反,A. xylinum这些复合体有稳定特性(Kudlicka, 1989)。值得一提的是在细菌纤维素合成期间A. xylinum细胞运动著名现象,使纤维素链挤出(Brown et al., 1976)A. xylinum细胞的反转运动能计算出典型链伸展率,每小时和每个细菌细胞
,这相当于2 µm 分和相对于8 一聚合物比10个葡萄糖分子成为β-1,4-葡聚糖还要大。如果这强势与亚纤维组装成束或带有关,强到足以转换所有A. xylinum细胞运动,这些力就可以很好影响CS亚单位空间排列,定位在膜的半液体脂双层中。
10. A. xylinum 纤维素亚纤维构造模式:1,脂多糖层,2,壁膜间隙,3,原生质膜,10 nm微粒,CS亚单位(Kudlicka, 1989)
β-1,4-葡聚糖链空间组装有分层特性(10)。在第一步,10-15个初期β-1,4-葡聚糖链形成一个亚单位(也叫原微纤维),直径1.5 nm,不是棒样机构,而是左转三螺旋(Ross et al.,1991)。亚纤维聚集物(扭曲)构成大量平行链组成微纤维。接下来是分层结构,是微纤维束,接下来是松散绕带,大约1000个单独β-1,4-葡聚糖链组成(Haigler, 1985)。在有Calcofluor(荧光增白剂)存在时,渗透进细胞包膜的外膜并与原微纤维形成复合物,它们聚集成微纤维就停止了。在有非常大的分子存在时,像CM-纤维素和木葡聚糖(Yamamoto et al., 1996),非常大穿过膜,装配成微纤维束和带,被分裂,于是表明这后两种结构形成排出纤维。Ross等人(1991), A. xylinum纤维素链结构联合分析,由Bayer (1979)首先报道在细菌细胞中存在,强调在细胞被膜内外膜附着特殊位置的重要作用。它们的发生就能使纤维素微纤维有了出口,不用与任何肽聚糖凝胶的相互作用,它们充满壁膜间隙。它们的相互作用能防止原微纤维之间调整氢结合的形成。
 
分子的孔洞结构,是否能使A. xylinum纤维素微纤维移动通过到细胞外,仍不知晓。属于CS操纵子(见74段)的bcsCbcsD基因表达产物的参与,在它们的形成中不能排除(Wong et al., 1990),这些表达产物表明对纤维素内部合成是越发至关重要(Ben-Bassat 等人., 1993)。还有三种蛋白作用:CSAP20, 54, 59CS-协同蛋白),必须详查。它们与纤维素结合与CS催化亚单位一起,在CS提纯试验中揭示(Benziman Tal, 1995)。可能,导致纤维素合成的复杂机制的其它成分分离和纯化,与A. xylinum CS操纵子的基因直接突变一起,可以有助阐述这些步骤在分子水平发生次序。
初始纤维素链组装过程与亲本A. xylinum细胞密不可分,展示一种独特和显著动力学。这些链的挤出及其组装成有序结构,是通过细胞运动反转辅助的。自始至终,β-1,4-葡聚糖合成和释放全过程,A. xylinum细胞沿着自身轴心转动(伸展运动)(Brown 等人1976)。还有,这运动是由带状物扭曲形式驱动的,停在挤出点,定位在延长细胞侧面。这些扭曲物在电子显微镜下明显可见。
7.4.纤维素生物合成的基因原理
纤维素生物合成涉及几种酶。它们的功能是从指导纤维素前体UDPGlc合成开始的,随后单体聚合。发现初期反应是由葡糖激酶,葡萄糖磷酸变位酶和UDPGlc
焦磷酸化酶催化的,不限制细菌纤维素合成最终速率,因为A. xylinum合成过量UDPGlc (Ben-Bassat 等人., 1993)。细菌纤维素合成速率是由二鸟苷酸环化酶和低聚物,CS调控复合物来控制的。因此,更有效产生纤维素A. xylinum突变株的结构,需要检测对这些酶的基因编码图表。这已由Wong 等人. (1990) Ben-Bassat 等人(1993)研究,已证明,细菌纤维素生物合成涉及4个耦合基因:bcsA (2261 bp), bcsB(2405 bp), bcsC (3956 bp), bcsD (467 bp),形成CS操纵子,长度9217 bp,和同时转录为多顺反子mRNA(信使核糖核酸)。
 
虽然由各基因编码蛋白功能,迄今尚未明确测定,有关其作用的某些信息,已由基因互补试验得出(Wong et al., 1990)。这些研究结果指出,CS-缺陷株能由基因bcsB补充,85-kDa蛋白(802氨基酸残基)指定编码,A. xylinum突变株CS和二鸟苷酸环化酶缺陷,由基因bcsA补充,为84-kDa蛋白(754氨基酸残基)编码(Ben-Bassat et al., 1993)。根据不同的突变株可推断CS复合物和c-di-GMP相互作用在蛋白A 应用部分,是CS异构催化,早期由Saxena 等人假设 (1991)。蛋白B能结合UDPGlc并合成β-1,4-葡聚糖链。催化亚单位(cesA)基因编码与基因bcsB相似(Wong 等人., 1990; Ben-Bassat 等人., 1993),另外Saxena等人描述,一年之后对调控亚单位(cesB).鉴定了基因编码。
但是,Saxena等人(1990a, 1991)推测CS操纵子头两个基因位置是对立的,并且CS催化亚单位是第一个基因编码。在bcsC bcsD 两种基因表达产物的作用,尚未明确测定。这些基因也可能是膜定位蛋白(分别是141 17 kDa)的编码,及在内部纤维素合成和从细胞分泌蛋白两者都是必要的。Ben-Bassat等人(1993)报道,bcsD基因分裂或缺失能明显减少纤维素合成。Saxena等人(1990a)Ross等人(1991)预计在CS操纵子,一些基因存在,能控制纤维素链组装。
还不清楚,在细菌纤维素合成中如果有质粒参与,就是,它能起什么作用。如果能证明,在A. xylinum ATCC 10245 (通常 17005)株的突变物60%质粒检测了组成和大小,是用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍诱变的,它们与野株有明显不同。这些观察提示,质粒结构和细菌纤维素合成之间似有连带关系。
移动的DNA碎片,包括插入序列(IS),特别在原核生物广泛分布,在长750–2500 bp(Galas Chandler, 1989),在许多基因调控是重要因子。ISs可以激活或灭活基因,并且可以启动DNA重新排列,像删除,倒置和整合。表明,ISs 参与Pseudomonas atlantica(假单胞菌属)(Bartlett Silverman, 1989), Xanthomonas campestris (黄单胞菌属)(Hotte 等人., 1990), Zoogloearamigera(粘液菌属)(Easson 等人, 1987).细胞外多糖合成的调控。它也有可能参与细菌纤维素合成的调节。
A. xylinum插入序列已能很好识别IS 1031 (950 bp,和已知核酸序列)。在大多细胞突变株与野株相比测到IS 1031外形改变。某些重组包括两个或更多IS 1031碎片。Coucheron(1991)观察到IS样品有更多明显改变,针对DNA重新排列并设法从灭活基因得到的分裂额外ISs之逆转株和得到假逆转株,在培养基表面产生蜡样物质,但纤维素合成能力不能修复。这些试验指出,有ISs存在有助于A. xylinum.的不稳定性。
 
 
7.5.细菌纤维素合成调节
-3,6:36二鸟苷单磷酸(c-di-GMP, 见图11)A. xylinum CS可逆变构催化剂并且在完整β-1,4葡聚糖生物起源调节起重要作用(Ross 等人1987).
11. c-di-GMP –结构A. xylinum CS.变构催化剂
这化合物与酶调节亚单位结合,并诱生构象改变,促进CS原聚体联合并导致反应增强(Ross等人1987).
A. xylinum细胞中c-di-GMP浓缩是由三种酶调控的:二脒基环化酶(CDG),磷酸二酯酶A (PDEA)和磷酸二酯酶B (PDEB) (12) (Ross 等人1987). PDEA PDEB定位胞质膜,并且CDG有两种形式。
其一是定位胞质膜和另外一个运行于胞质中(Ross et al., 1991)。最近,Weinhouse 等人(1997)报道一新的c-di-GMP-结合蛋白,大概也能参与细胞内游离c-di-GMP浓缩。Tal等人(1998)证明,在A. xylinumc-di-GMP细胞反转是由三个操纵子控制的。
 
12. A. xylinum纤维素合成提出的模型。为简单起见,描述了单一β-1,4-葡聚糖链的合成,虽然CS更复杂形,是同时聚合数个链,在纤维素生物原中或许可激活酶单位(Ross et al., 1991; with kind permission)PDEA,磷酸二酯酶APDEB, 磷酸二酯酶BpppGpG, 二磷酸-di-GMP; pGpG (II), c-di-GMP (cyclic-di-GMP);pGpG, di-GMP (线型 di-GMP).
CDG,A. xylinum纤维素合成系统中的关键调节酶,由两个多肽链和两个基因编码组成(Nichols Singletary, 1998)CDG由镁离子活化和特定受皂素抑制(Ohana 等人1998),是一种糖基化的类萜。CDG转换成两个GTP分子首先进入线型(pppGpG)和然后进入环(c-di-GMP)单磷酸二鸟苷酸,活化CSPDEA分裂物激活c-di-GMP进入线型灭活二聚物(pGpG, di-GMP),PDEB进一步分解成两个5GMP (12)分子。PDEA受钙离子抑制,但不影响PDEB。因此,浓缩物间接影响纤维素合成速率。这些钙离子高浓度能增强这速率,后来c-di-GMP转换非活性线型被抑制。
 
相信CS分子实情是受c-di-GMP激活的及它合成调节涉及CDG正面影响和PDEAPDEB的负面影响,这是其独有特征。迄今,有关纤维素合成调控机制只是在A. xylinum发现
7.6. A. xylinum可溶多糖合成
除了纤维素之外,某些相关可溶多糖也可由A. xylinum合成。
1970年代,测到一种可溶β-匀质葡聚糖。它主要是由β-1,4-链接葡萄糖残基和这链每第三个葡萄糖部分有另外一个葡萄糖亚单位是由β-1,2链接的(Colvin and Leppard, 1977; Colvin et al., 1979)A. xylinum纤维素不形成菌膜(Pel)株合成α-葡聚糖与细胞被膜相连(Dekker 等人1977)Valla Kjosbakken (1981)分离了从培养基中分离到一可溶多糖含Glc, Man, Rha,和葡萄糖醛酸残基(各自克分子比率 3:1:1:1)。所述聚合物由相同部分(改变各自克分子比率6:2:1:1)组成,由另外细胞株合成,是由Minakami 等人测到的 (1984)
这些聚合物某些残基可能被乙酰化(Tayama et al., 1985)
这型多糖常用名乙酰素(acetan(De Lannino 等人1988)
此外,某些A. xylinum野株也能合成类似可溶多糖(Glc, Man,Rha, 葡萄糖醛酸,各自6:1:1:1)和纤维素(Savidge Colvin,1985)
问题是纤维素伴同可溶多糖在其生物合成中起什么作用。看来它不起任何直接作用,即使生物合成动力学与纤维素是相同的(Marx-Figini and Pion, 1974),而且UDPGlc优先用于这些可溶多糖产生代替纤维素产生, (Delmer, 1982)。某些作者叙述内部初始纤维素微纤维,由非晶体物质包裹(Leppard et al., 1975),可由上述可溶多糖组成。在静止培养基液体部分这些可溶聚合物缺失及其纤维素膜存在证实了这个设想(Valla Kjosbakken, 1981).
更早,Ben-Hayyim Ohad1965年揭示,在培养基中存在CM-纤维素,用于细菌纤维素合成,导致纤维素这种可溶衍生物合进聚合物微纤维中。然而,A. xylinum外多糖结合进入纤维素微纤维尚未观察到。
7.7. A. xylinum内和外纤维素酶合成的作用
有关A. xylinum纤维素酶开始报告是由Okamoto 等人 (1994) Standal 等人 (1994),各自发现的,包括对其基因的描述。初期的作者从A.xylinum IFO 3288 DNA基因库选择一个基因为24-kDa蛋白(218个氨基酸残基)编码,显示CM纤维素酶活性。Standal 等人(1994)A. xylinum ATCC 23769细胞突变株发现另外内纤维素酶基因,定位在CS操纵子上部。显示从基因分裂产生纤维素酶合成能力丧失。
Tonouchi 等人 (1997)的结论,研究A. xylinumBPR 2001 -1,4-β-葡聚糖酶基因的定位,是相似的。这后者基因是定位在CS操纵子上部,而第二个纤维素分解酶基因,是由这菌株产生的,即外-1,4-β-葡糖苷酶,在这操纵子下部发现。
A. xylinum BPR 2001--纤维素酶已被提纯和描述特征(Oikawa 等人
1997; Tahara 等人, 1998)Tahara等人研究(1997)还报道,pH 5.0是细菌生长和细菌纤维素合成的最佳条件,两种细菌纤维素酶活性比在pH 4.0高几倍,这时细菌纤维素产生稍降低。还观察到,在pH 5.0,在培养期间平均DP16,800 降到11,000,而在pH 4.0,这些改变可忽视。在pH 5.0得到纤维素物理特性差,即是,低抗拉强度(低Young弹性值)。
这些结果及纤维素酶和CS操纵子基因定位,提示在A. xylinum纤维素生物起源涉及内-1,4-β-葡聚糖酶和外-1,4-β-葡糖苷酶(Tahara, 1998)
特别是,在生长后期合成中,它可能与初始β-葡聚糖链降解有关。而且,A. xylinum BPR 2001-1,4-β-葡糖苷酶显示在水解和转糖基活性两方面(Tahara et al., 1998),与其它糖苷酶相似,在端基碳结构不引起倒置。这后者活性可对聚合物平均DP内部改变负责,然而,必须进一步研究去解释这设想。对这可能性的初步证据是黄豆细胞试管培养的表现。其β-葡糖苷酶活性,还有转糖基活性,加之细胞长度增加,因为这种酶特别参与在半纤维素前体糖苷残基转移到细胞壁的生长末端,这里发生多糖集中合成(Nari et al., 1983)
无论A. xylinum纤维素酶是否涉及在饥饿期纤维素形成释放储备能量,这一直是待解答的问题,虽然有些研究证实了这论点(Okamoto et al., 1994)。已知某些菌核内-1,3-β-葡聚糖酶也在起作用(Jones et al., 1974)
最近观察指出,细菌纤维素的物理特性和DP的改变,应用一些化合物影响其生物合成,或是用A. xylinum纤维素酶开发其活性和特异性已获得成功。
8.细菌纤维素的生物降解
无论它的起源如何,纤维素都能彻底自然降解。
然而,与植物纤维素相比,有关两者聚合物都易降解,像半纤维素和果胶,木质素,是最耐久的植物聚合物,细菌纤维素相对纯净并更易受水解纤维素酶的攻击,这酶主要由真菌和许多细菌产生。在这方面,细菌纤维素的商业应用对环境是无害的。
而且,细菌纤维素的结构和特性(大到表面区)使它能作为纤维素酶(1,4-β-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶, 之前细胞内酶, EC 3.2.1.4)和纤维素生物水解酶(纤维素1,4-β-纤维素生物水解酶,EC3.2.1.91),这是纤维素体罚主要部分,从纤维素水解菌及纤维素分解真菌系统得来特异多酶粒子。
近来,Boisset等人(1999)证明Clostridium thermocellum纤维素体比微晶Valonia ventricosa纤维素分解A. xylinum纤维素微纤维更快。应用传动电子显微镜,红外光谱和X-线衍射分析,对水解过程超微观察指出,细菌纤维素快速水解是纤维素体架构中存在的各种酶成分高效协同作用的结果。Boisset等人(2000)进一步研究表明Humicola insolvens纤维素生物水解酶Cel7A (之前CBH I)致分散细菌纤维素带薄化,而Cel6A (CBH II) Cel7A (各自比率 2:1)的化合物把带切成更小的片,于是提示部分CBH II攻击的内方式。几年来已知某些外切葡糖聚酶低固有内活性现象,并与内切葡糖聚酶比较说明纤维素生物水解酶的相同作用更有效(Teeri, 1997)。按目前观点,多样内切和外切纤维素酶系统,细菌纤维素体和真菌纤维素水解复合物两者,代表完美平衡连续活性,为各种纤维素基质提供有效降解。
 
Samejima 等人 (1997)观察到细菌纤维素对纤维素酶的敏感性,发现Trichoderma viride CBH I和内切葡聚糖酶II的混合物,彻底分解微纤维束扭曲和弯曲带样结构成线针样微晶体,并且还引起聚合物快速破碎。细菌纤维素丝带盘绕结构转变为针样,是由基片非凡盘绕动作驱动的,可能是张力释放的结果,当纤维素酶使微纤维质降解成更短的碎片。Samejima 等人 (1997)还测到,酸处理细菌纤维素,含有许多微纤维凝聚物,对两种酶攻击不敏感。
Srisodsuk 等人 (1998)也得到类似结果,用Trichoderma reesei CBH I消化微晶细菌纤维素并观察到这聚合物迅速溶解,但它的DP缓慢下降。从这微生物得到的内切纤维素酶以相反的方式攻击这基质。
两种酶水解棉花纤维素比细菌纤维素更缓慢,尽管棉花纤维素与其它植物相比表明有相当高纯度。
细菌纤维素对纤维素酶的攻击敏感的原因之一,是它有大的表面区,实际上增强全面水解和促进纤维水解酶有效结合,这是降解过程重要步骤。这结论是基于Palonen 等人 (1999)研究,发现许多T. reesei CBH I CBH II分子与细菌纤维素链接,增强了水解作用。而且,CBH II结合明显更强(从基质得到的酶吸附/脱吸附,60–70%磁滞来辅助),指出这酶明确的不同处理特性。
 
Stalbrandt 等人(1998)比较了四种Cellulomonas fimi(纤维素菌属)内切-和外切-纤维素酶抗微晶细菌纤维素和酸胀Avicel(结晶)纤维素的攻击模式。
后者对所有酶分解更有效。在多数情况观察到45–65%溶解和DP下降,Cbh B例外,引起27%溶解。已知加工酶Cbh A,达到高度细菌聚合物溶解(67%)Stalbrandt 等人 (1998)的结果证明只是细菌纤维素原纤维外表面接触C. fimi纤维素酶因为Cbh A是处理酶,它比另外三种纤维素酶清除外部原纤维更迅速并且可攻击聚合物更深内表面。因此,其它酶(两种非加工内切纤维素酶和Cbh B,显示更弱加工特性)不能有效溶解细菌纤维素。
而非结晶溶解纤维素对这些都同样有效。
 
近来研究指出高度结晶细菌聚合物完全消化不会引起任何问题,在自然环境中产生的大量各种各样内切-和外切-纤维素酶对细菌纤维素生物降解的生物应答,它们互相活性补充。而且,与之相对的植物原纤维素,需要预处理,以保证酶容易转换糖,细菌纤维素能直接被纤维素酶消化。
9.生物技术生产
为了达到细菌纤维素的高生产率和收量和降低其生产成本,要特别强调以下方面:
提供选择A. xylinum菌株筛选方法的开发,能从各种廉价废物碳源有效生产纤维素,从筛选得到的野株应用基因工程方法得到改善,A. xylinum的最佳培养条件(静止和搅拌培养、发酵罐型),细菌纤维素的形状(菌膜或是无定型凝胶)和特性(恢复力、弹性、机械强度、吸收能力)的测定,必须适合进一步聚合物应用、培养基成分的优化(碳和氮源、生物合成促进化合物、微量元素等)工艺条件(pH、温度、通气)。
这些将在后面讨论。
 
9.1.细菌纤维素产生株的天然分离和改良
选择适宜A. xylinum株的方法之一是从一些菌株来筛选,不能氧化葡萄糖由葡糖酸到2-, 5-, 2,5-酮葡糖酸(Winkelman andClark, 1984; Johnson and Neogi, 1989; De Wulf et al., 1996; Vandamme, 1998)。在这方面和BrO离子,De Wulf et al. (1996)应用一种含Br的琼脂营养培养基结合酸性pH以释放对A. xylinum细胞有毒的溴分子。只是这些突变体,不能把葡萄糖转变成葡糖酸或其衍生物,能存在于培养基之中。
Vandamme et al. (1998)成功应用这种方法去分离A. xylinum KJ33株,能产生3.3 g纤维素L. A. xylinum菌株,不能代谢培养基含有的葡萄糖成葡糖酸(Johnson and Neogi, 1989)。另外一些酸,能从CaCO3选择的方法避免葡萄糖向有机酸的转换,选择有缺失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变,在搅拌培养中完成。为相同目的,即最好纤维素产生株的筛选,已应用向生长培养基中加入纤维素酶的方法(Brown, 1989c)
 
用化学化合物突变,如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍或乙基甲烷磷酸盐,以及用紫外光照射得到突变物,显示有更高的纤维素产生力,减少可溶多糖腊脂合成和非常低级葡萄糖向有机酸的转换(Johnson and Neogi, 1989)
A.xylinum菌株的筛选还有随意分离或诱生纤维素II-产生突变的目的。这种纤维素是由细菌合成的,形成光滑菌落并且不能在营养培养基表明产生薄膜。相反,聚合物是分散在整个培养基容积之中的。
 
最好的细菌纤维素产生筛选也有传统操作,是用个别单独培养的合成物活性测定的。例如,Toyosaki et al. (1995)从大量植物(水果,花卉)样本分离2096醋酸菌株和在营养培养基表面形成膜的412株进行深入研究。
产生A. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001 –菌株的过程,是在搅拌培养中有效合成细菌纤维素的。
9.1.1.应用基因工程改良纤维素产生菌株
除了A. xylinum以外微生物的各种糖酶基因密码表达,增加可利用碳源的范围,可以增加细菌纤维素的产量和降低培养基价格。以醋酸菌属的Leuconostoc mesenteroides基因蔗糖磷酸酶表达为例(Tonouchi et al., 1998),利用蔗糖作为碳源和增加纤维素产生。此外,Nakai等人(1999)在A. xylinum株从绿豆(Vigna radiata, Wilczek)基因突变蔗糖合成酶表达的方法得到双倍纤维素产量。突变酶,这11丝氨酸残基,由谷氨酸替代(S11E);这引起工程酶对UDPGlc合成中蔗糖和有助糖裂解有更高亲和力。突变基因引入A. xylinum在重组株改变了蔗糖代谢,但针对UDPGlc合成也建立了一新路径(Figure 13)。能量操纵这过程是葡萄糖的糖苷键裂解而不需要任何其他能量投入,这是UDPGlc由常规路径合成时的情形。此外,在葡萄糖聚会过程产生的UDP分子能直接通过蔗糖合成酶活性再利用,观察到偶联反应速率增加和纤维素合成有更高比率。应该强调在高等植物UDPGlc合成具有两个系统。
13.A. xylinum重组株的UDPGlc生物合成途径包括蔗糖合成酶(SucS)基因。其它缩写与图6相同,(见7.1段)。
9.2.发酵生产
液体培养基表面生长和皮样垫胶状物形成是A. xylinum菌株的天然特性。
因此,静止状态似乎是细菌纤维素合成的最佳条件。然而,静止培养的主要缺点是,如在聚合物形成,只是能形成膜片和有相当低的生产力,应该促进新发酵工艺的发展。
9.2.1.碳和氮源
在细菌纤维素生产收量的影响因素研究中,多集中在碳源。多在单、双和多糖、乙醇、有机酸和其它成分,相比Jonas Farah (1998)发现首选碳源是D-阿糖醇和D-甘露醇,而结果与葡萄糖相比是各自产生高达6.2 3.8倍纤维素。这两种糖醇在整个培养期间提供了pH稳定性,因为它们不能转换葡萄糖酸。
Tonouchi 等人 (1996),应用一A. xylinum菌株从葡萄糖和果糖得到纤维素,发现果糖刺激磷酸葡萄糖异构酶和UDPGlc 焦磷酸化酶活性,因此增加纤维素的收量。
当在营养培养基(Masaoka, 1993)中麦芽糖是唯一碳源时,细菌纤维素的产生比含葡萄糖培养基低10倍和聚合物比有葡萄糖(DP=11,500)存在明显更短(DP=4000–5000)
Matsuoka等人 (1996)研究了使用A. xylinum ssp. 乳糖发酵 BPR2001菌株在搅拌培养中纤维素合成并发现在生长培养基中有乳酸存在能刺激细菌生长和提供纤维素收量4--5倍。乳酸的来源通常是玉米浸泡液(CSL),它是细菌纤维素生产应用培养基的主要成分,特别是在搅拌培养。与葡萄糖和果糖相比,乳酸不能转换UDPGlc,但在柠檬酸循环中经丙酮酸和草醋酸代谢,这是纤维素产生的能源。向生长培养基中提供乳酸,可进行乳酸菌和醋酸菌的混合培养。使用Lactobacillus, Leuconostoc, PediococcusStreptococcus菌株得到最好结果。乳酸菌和醋酸菌在有蔗糖水解物酵母(β-呋喃果糖苷酶产生物)存在也能生长。这方法提供细菌纤维素高收量,在搅拌培养14天之后得到,纤维素8.1/(Seto et al., 1997),乳酸菌株,只有6.4/升。
纤维素合成刺激化合物之一好像是乙醇(Naritomi et al.,1998) A. xylinum在含果糖培养基中连续培养,显示10乙醇/升,增加细菌纤维素收量,但浓度在15/升则阻止聚合物合成。这些结果提示与乳酸类似,乙醇也是一种能源(积聚ATP)并不是纤维素合成的基质。ATP激活果糖激酶和抑制葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,因此阻止6-P-葡萄糖向6-磷酸葡萄酸转化,可推断,由于这些偶联反应-果糖总量深入异构化至葡萄糖-6-磷酸增加。
 
每个产生纤维素菌株都需要一特殊复合碳源,不仅要提供氨基酸、还有维生素和无机盐。这些需求可使用酵母提取物、CSL及酪蛋白和其它蛋白水解物来满足。首选氮源是酵母提取物和蛋白胨,由Hestrin Schramm (1954; H-S medium)开发了典型培养基的基本成分,应用于大量细菌纤维素合成研究。但是,在搅拌培养多推荐的碳源是CSL(Johnson and Neogi, 1989)。还发现,在昂贵培养基成分的主要部分,即酵母提取物和细菌蛋白胨,能用CSL或包心菜汁代替。还有工厂废弃物质,如甜菜糖浆,从淀粉水解物分离葡萄糖之后的废液以及乳清和某些工业发酵废物(即用乙醇沉淀右旋糖酐之后的废液)是适宜的培养基成分(Krystynowicz et al.,2000)
在细菌纤维素合成中维生素的影响研究(Ishikawa et al., 1995, 1996b)表明有最大促进有吡哆醇、烟酸、对氨基苯甲酸和生物素,并且甚至CSL培养基也能用这些物质强化。也鉴定出某些其它成分,也能强烈刺激A. xylinum菌株产生纤维素,像胆碱asjunz衍生物、甜菜碱和脂肪酸(盐和酯类)(Hikawu et al., 1996)。应用最佳生长培养基成分能达到高细菌纤维素的产生(至25/升)是通过数学法和计算机分析设计的(Joris et al., 1990; Embuscado et al.,1994; Vandamme et al., 1998; Galas et al., 1999)
9.2.2. pH和温度影响
pHA. xylinum纤维素产生和特性的影响分析指出,最佳pH取决于菌株和通常变化在4.0 7.0 之间。(Johnson and Neogi,1989; Galas et al., 1999).例如,Ishikawa 等人. (1996a) Tahara 等人. (1997),应用两个不同的A. xylinum菌株,在pH 5.0观察到产生聚合物最高。Krystynowicz 等人. (1997)也发现在同样pH最理想。在不同pH所得聚合物的吸附特性比较,这些纤维素是在S-H培养基中pH 4.8–6.0积聚的,表现有最高水结合能力(Wlochowicz, 2001)。除了培养基的pH之外,还有温度在影响细菌纤维素的收量和特性。大量的试验报道温度范围在28-30°C,并且它的变化能引起纤维素DP和水结合能力的改变。例如,在30 °C与在2535°C细菌纤维素的合成产生比较有较低DP(约10000)和更高水结合力(164%)(Wlochowicz, 2001)
9.2.3.静止和搅拌培养;发酵罐型
细菌纤维素合成无论是运行在静止培养还是沉没状态,提供适当搅拌和充气,对于培养基的匀质和有效质量转移都是必要的。培养条件的选择完全取决于聚合物用途和目的。
在静止培养中产生的纤维素主要取决其表面/容量比率。最佳表面/容量比率可以不受非常高(不必要)或是非常低的充气(细胞生长和纤维素合成终止)的影响。报告表面:容量比率的值变化在2.2 cm -0.7 cm。在静止状态细菌纤维素合成可以通过一步(培养基中含5–10%细胞悬液)或两步程序来完成。后者是从搅拌发酵开始的,然后是静止培养(Okiyama et al., 1992)Krystynowicz et al. (1997)改良了这两步程序并且所应用的细胞,是在两步程序静止培养中得到的。薄膜含有A. xylinum E,第一步(24h),切下一致的片并用作启动下次培养的第接种物,运行4-5天。这方法能提供均匀的细菌生长并产生一致的膜片。
在静止培养中细菌纤维素合成的控制是非常困难的,因为膜片是浸进液体培养基中。一特别重要参数,需要持续控制,就是pH
pH值对生长和多糖合成有最佳影响。因为pH调节的常规方法不能用于静止培养,Vandamme等人(1998)应用一种内部pH控制,是通过最佳发酵培养基设计,放入乙酸作为Acetobacter sp. LMG1518d 的附加物。乙酸代谢产物阻止了由酮-葡萄糖酸盐形成引起的pH降低,并为生长培养基全程提供了5.5恒定的pH
更好的细菌纤维素合成控制能在特殊发酵罐中取得。在水平发酵罐中产生的纤维素,它提供了静止和浸没相结合的培养。这聚合物是在沿长轴旋转的滚筒或圆盘表面之上(Figure 14)。它的表面部分暂时浸泡在液体培养基中或是在其表面(空气中)之上。这方法的优势包括有更大聚合物表面,纤维素合成是一型中空纤维,不同直径及好的程序控制,容易规模化,对细菌附着和产生沉积有事宜表面,有更好的基质利用,更高速率产生纤维素,可以补充营养,在加工过程有更多通气,等等。(Sattler Fiedler, 1990)Bungay Serafica (1997)在一升盘(直径12 cm)发酵器中生产细菌纤维素并且表明最佳糖(蔗糖或葡萄糖)浓度是10 g L,圆盘转速12 r.p.m.和恒定pH 5.0Krystynowicz等人 (1997)成功应用11-升反应器含有细菌纤维素菌株H-S培养基3(Figure 15)。它的11个盘(每个直径12 cm)最佳转速大约3 r.p.mA. xylinum E25合成纤维素干重,在生长7天之后得到多达4.2 g L
14.在水平发酵器中滚轴表面形成A. xylinum纤维素。
15.在旋转盘发酵器中盘沉积A. xylinum纤维素。
在深层培养中细菌纤维素的产生通常需要普通发酵罐,装备有某些静力部分(挡板,刀片等),能使细胞粘附,因为纤维素在自由水相中合成通常是滴状的。同样,在各种水不溶微粒,如沙,硅藻土或是玻璃珠,加入到培养基中,会增加细菌纤维素的产生,因为细菌在颗粒上形成的生物膜大概受限于氧传输,并且葡萄糖氧化葡萄酸停止(Vandamme 等人1998)
大规模纤维素生产,用持续搅拌和通气的发酵罐会遇到许多问题,包括自然发生细胞突变,造成纤维素生产衰退。最佳搅拌和充气能防止动荡,波动会在纤维素聚合和结晶有负面影响,能降低多糖产量。例如,搅拌速率达到60 r.p.m.和充气每分钟每容量0.6容量(v.v.m.)A. aceti ssp. xylinum ATCC 2178株在一300-L发酵罐在30 °C培养45小时和得到10 g BC L d(Laboureur, 1988)Ben-Bassat等人(1989)研究在14-L Chemap发酵罐中A. xylinum 1306–21株细菌纤维素生产,在含葡萄糖和CSL2%CSL培养基中培养。搅拌速率相对于900 r.p.m.和溶解氧浓度相对于30%气体饱和。聚合物收量5.1 g L dChao 等人(2000)应用一50-L内部环流反应罐用A. xylinum sp. BPR2001株细菌纤维素合成。用浓缩氧气体充气,67小时之后,纤维素收量从3.8 增加到 8 g L
在发酵罐细菌纤维素产生遇到真菌或链霉菌培养类似搅拌问题,因为这些微生物多数生长小球或细丝形及它的培养基变为非牛顿液体。在各种形状颗粒的浓稠悬液中形成高浓度菌丝限制搅拌和气体输送。搅拌速率增加以改善充气和由于剪力引起的产品结构破坏。Bauer 等人(1992)把这情况加以考虑并在生长培养基中加入聚丙烯酰胺保护剂,用于发酵罐中细菌纤维素合成。这种保护剂减少了剪力破坏并影响特别高密度生产是否定的,因为使细胞生长率降低。
某些代谢物的积累也能影响纤维素的产生。例如,Kouda 等人 (1998) 研究表明高分压二氧化碳对A. xylinum生长有负面影响并且减少细菌纤维素收量。
Laboureur (1998)开发了一种方法应用A. xylinum sp. ATCC 21780株在300- 500-L发酵罐,培养基含5%蔗糖,0.05%酵母提取物,0.2%枸橼酸,氮盐,镁和磷酸盐,生产细菌纤维素。培养基用12%接种物接种,培养160小时。这过程是在30°C运行45小时和pH 4.8,和充气速率0.6 v.v.m。细菌纤维素合成收量达18 g L d(10 g L d). 另外菌株Acetobacter sp. ATCC 8303,28 °C pH 4.6,生长,应用改良培养基,含0.28%葡萄糖,0.07%麦芽糖,0.03% CSL,0.03%酵母提取物。充气开始是1 v.v.m.33小时和这过程的最后是0.5 v.v.m,细菌纤维素的收量是13 g L d
向大容量发酵罐准备适宜细胞密度的接种物也是个问题,主要是因为是包裹在纤维素之中。为释放细胞和增加其密度,Brown (1989c)应用纤维素酶制剂使部分纤维素溶解。有这些酶存在时,细胞密度达到10mL,而缺失酶时,只有1.1210 mL,在生长30小时之后。
除了上述方法之外,各种直径中空原纤维形的纤维素生产也在试验(Yamanaka 等人1990)。这样的材料对小直径血管的生产应该是特别有益的。这中空细菌纤维素原纤维素在一种氧可渗透空心载体的内和/或外表面细菌纤维素产生菌生长得到的,产生形状,例如,玻璃纸,特氟龙,硅树脂,陶瓷等。
9.2.4.连续培养
微生物纤维素也能做静止连续培养产生(Sakair 等人1998)A.xylinum株在一些盘上生长,在S-H培养基中,2天之后在表面获得薄膜产生,通过十二烷基磺酸钠洗浴以杀死细胞并放在通风滚筒上。这过程继续几周,滚动速率35 mm h
和每8-12小时把新鲜S-H培养基加入盘中以保持其最佳水平。应用这方法可以收集大于5 m的纤维素细丝,指出它有工业应用潜力。
9.3.外部生物合成
纤维素外部合成是纤维素研究领域最困难题目之一。第一,纤维素合成是利用纤维素酶“逆作用”, Kobayashi 等人(1991)作为催化剂,虽然化学合成方法在以前已应用。几种单体和催化剂已应用(Nakatsubo 等人1989),但都没有得到理想产品,β-1,4-链接葡糖吡喃糖的立体定向聚合物。外部细菌纤维素合成的想法是从应用A. xylinum无细胞提取物(Glaser, 1958),膜的粗制(Colvin,1980;Swissa 等人1980; Aloni 等人1982),和用洋地黄皂苷膜溶解物实验得来的(Aloni 等人1983)。这些研究证明UDPGlcA. xylinum纤维素合成基质,c-di-GMP是特异催化剂(Ross 等人,1987),及钙和镁离子对这过程是至关重要的(Swissa 等人, 1980)。外部合成是用洋地黄皂苷溶解A. xylinum细胞膜进行的(Lin 等人,1985),得到纤维素纤维直径17 ± 2 Å
9.4.化学-酶合成
在纤维素化学合成实验中尚未得到预期结果。分支和低分子量葡聚(Husemann Muller, 1966)β-1,4- and α-1,4-链接葡糖吡喃糖的聚合物(Micheel Brodde, 1974)被得到。
 
Kobayashi 等人 (1991)成功实验指出,应用联合化学和酶方法可以导致纤维素外部合成的商业发展。
作者应用β-D- cellobiosyl氟化物,通过化学合成方法得到,一种基质和T. reesei纤维素,在水-有机溶剂系统(乙酸缓冲液pH 5.0和氰化钾烷,1:5 v/v 的一种混合物)中催化并获得水不溶“合成纤维素”,用DP > 22. X-线C-NMR分析表明这产物是纤维素II
作者叙述产品的DP取决于反应条件,特别是水-有机溶剂成分。他们发现更高浓度基质和乙腈存在,这纤维素酶,作用如糖基转移酶-主要产生可溶纤维低聚多糖(DP 8),还可发现许多用途。虽然这些研究没能继续,由Kobayashi提出的方法对外部纤维素产生对所有酶有望做出选择。
 
9.5.预期未来应用的产品加工
最近,一大规模细菌纤维素生产独创方法是由Nichols Singletary (1998)提出的,应用转基因植物结构专利想法去生产这种聚合物的可能性。作者想表达三种A. xylinum CS基因(bcsA, bcsB, bcsC, 7.4)和在作物(马铃薯,玉米,燕麦,高粱,小米,小麦,稻,甘蔗等)的存储组织(根,块茎,谷粒)中两个A. xylinum二甲脒基环化酶基因。他们设想得到大量纯聚合物,容易和廉价收获。按照他们的方法,生产要比发酵法更便宜。作者还强调他们的程序在生态学方面,因为纯纤维素生产转基因植物的培育的附加利益,将比使用森林资源更经济。
9.6.复原和纯化
经过静止或搅拌培养得到的微生物纤维素不是很纯并含有某些杂质,像培养基成分和A. xylinum完整细胞。在用于医药,食品加工,或甚至造纸业之前,必须去除所有这些杂质。
最广泛应用纯化方法之一是基于用NaOH,稀释酸,氢氧化物(以钠和钾为主),氯化钠或次氯酸溶液,有机溶剂或热水处理细菌纤维素。这些试剂可以单独或联合使用。(Yamanaka等人1990)。细菌纤维素浸泡在这样溶液中(14-18小时,某些情况达24小时),升高温度(55–65 °C)能明显减少细胞数和着色程度。
还有报道预先用自来水冲洗之后在2% NaOH溶液中煮沸(Yamanaka 等人1989) Watanabe等人(1998a)这聚合物在0.1 NaOH 80 °C浸泡20分钟然后用蒸馏水洗涤。Takai等人(1997)用蒸馏水和2% NaOH处理细菌纤维素,用2%乙酸中和这膜。
Krystynowicz 等人. (1997)开发了一种程序开始用自来水清洗初始细菌纤维素(过夜),随后在1% NaOH溶液中煮沸2小时,在自来水中洗涤以彻底去除NaOH1天),用5%醋酸中和,再用自来水去除它。获得的最终细菌纤维素制剂含有不足3%的蛋白,适于某些食品和医药目的。
细菌纤维素医学应用需要特殊处理以去除细菌细胞和毒素,因为它们能引起热源反应。最有效的方法之一是开始用可吸收的片材从两面轻轻压挤纤维素膜以排除80%的液相,然后把膜垫浸泡在3% NaOH12小时。这过程要重复3次,之后把膜片浸泡在3% HCl溶液中,挤压并在蒸馏水中彻底清洗。
纯净膜经高压消毒或是钴60照射。它可作为良好的创伤绷带,因为它仅含1–50 ng脂多糖内毒素,而应用常规方法纯化细菌纤维素通常会含有30 µg或是更多的这些物质。(Ringet al., 1986).
10.特性
细菌纤维素是一种非常难溶解、有弹性和易伸缩的聚合物,有很强拉力。它是网状结构,是由高度结晶和高度单向纤维素亚原纤维组成大量的带状原纤维。这是三维结构,在植物原纤维素是看不到的,这导致了细菌纤维素高结晶指数(60–70%)。而且,植物聚合物纤维比细菌纤维素的微纤维要粗100倍,因此细菌聚合物有大200倍的可及面。以搅拌培养A. xylinum纤维素做比较,在静止状态下聚合物合成,有更高DP(各为14,400 10,900)、结晶指数(各为71 63%)、拉力强度(Young's系数各为33.3 28.3)、但有低水容性(每克细菌纤维素各为34170)和在它分解形态悬浮粘度(各为0.04 0.52 Pas,(Watanabe et al., 1998a)
微生物纤维素表现是凝胶状的,因为它的液体成分(通常是水)存在于非常细小的带的空洞中,重量至少在95%。细菌多糖有高容水性,但大部分水不与聚合物结合,用轻微压力就可以挤出。干燥的细菌纤维素可形成纸片形状,厚0.01–0.5 mm(Yamanaka et al., 1990; Krystynowicz et al., 1995, 1997)并有良好吸收特性。除了有高Young's系数外,细菌纤维素还显示有高音速并且因为这些独特机械特性,它能应用于声膜(Vandamme et al., 1998).
细菌纤维素的特性在它合成期间和培养期间完全被改变。某些成分,像纤维素衍生物、磺酸、烷基磷酸盐、或其它多糖(淀粉、右旋糖酐)、可以进入营养液中改变其肉眼形态、伸展力、光密度和最终产物的吸收特性(Yamanaka et al., 2000)。细菌纤维素还能与其它物质结合,加入湿或干的纤维素,以得到理想的理化特性成分Yamanaka, 1990)。为了这个目的应用的添加物是由各种各样的无机和有机成分组成,像铝、玻璃、琼脂、海藻酸盐、carragenan、支链淀粉、葡聚糖、聚丙烯酰胺、肝素、polyhydroxylalcohols、明胶、胶原等。它们通过注入、迭片或是吸收、或是与分解聚合物混合,与细菌纤维素片组合。这复合材料能进一步使之成形处理,于是可得到各种产品。
近来,Kim 等人(1999)报告应用L. mesenteroides (葡聚糖产生菌)dextransucrase(葡聚糖生成酶) alternansucrase(交替蔗糖酶)改变细菌纤维素的酶促方法。在有A. xylinum ATCC 10821存在时合成“可溶纤维素”,由1,4-, 1,6-, and 1,3-链接单体组成葡聚糖。
 
细菌纤维素基本特性见表2.
2.细菌纤维素特性
高纯度
高结晶度
比传统木纸浆有更大面积
薄片密度300 900 kg m
高拉伸强度,即使是在低薄片密度(500 kg m以下
高吸收力
高结合水能力
高弹性、顺应性和耐久性
无毒性
代谢惰性
生物相容性
易生物降解
维持良好形状
容易剪裁的理化特性
 
11.应用
细菌纤维素公认是安全(GRAS)多糖并因此它早已有各种各样应用。它的商业应用就是这聚合物的独特性质决定的并且根据在廉价废料改良细菌菌株的生长使生产的有效技术的发展。细菌纤维素的优点是它的化学纯度和没有在植物多糖中通常存在的物质,那需要费力提纯。除了细菌纤维素膜片形状之外,它的面积和厚度,可以通过培养条件来定制。
在它生物合成期间相对容易使细菌纤维素改变,对一些特性如分子聚集、弹性、顺应性、容水能力、结晶度指数等进行规定。细菌纤维素微纤维可于低分子量物质和聚合物结合,这例子是加入生长培养基中,于是得到新奇商品。细菌纤维素也是未来化学变型的原料。
 
估计,在一公顷(一万平方米)表面区域每年从静止培养可得到多达10,000 kg(公斤)(10吨)细菌聚合物而在同样时间、同样区域、棉花只能收获600 kg(公斤)(16.6倍),细菌纤维素的广泛应用前景变得越来越明显。
细菌纤维素的主要潜在应用概述在表3.
 
3.细菌纤维素应用
部门应用:
化妆品:乳剂稳定剂如面霜、滋补剂、护甲素和亮光剂、人造指甲成分。
纺织工业、人造皮肤和织品、高吸附材料。
旅游和运动:运动衣、帐篷和野营器材。
矿业和炼油厂废物、溢出油收集海绵毒素处理吸收和矿物质和油回收材料。
污水净化:城市污水净化和水超滤。
麦克风和立体声耳机播放灵敏膜片。
林业:人造木村替代品、多层胶合板和耐用容器。
造纸工业:专业纸、档案文件修复、极耐用钞票、尿布和餐巾纸。
机械工业:车体、飞机部件和火箭壳裂缝密封。
食品生产:食用纤维素和椰果(‘nata de coco’)。
医药:褥疮、烧伤和溃疡治疗的暂时人造皮肤,牙齿成分和动脉植入物。
实验室/研究蛋白固定、色谱技术和体外组织培养介质成分。
 
11.1.科技应用
与植物纤维素片材相比,细菌纤维素即使是在低密度板也有满意拉力。(300–500 kg m) (Johnson and Neogi, 1989)。因此,细菌纤维素是造纸的极好成分,能提供更好机械特性。细菌聚合物的微纤维形成大量氢结合物,当纸被干燥,就得到改善化学粘附和拉力强度。含细菌纤维素的纸不仅表明对固体添加物有更好抵抗,如填料和染料,而且还有更大弹性、可透气、抗撕裂和充暴力、能结合更多水(Iguchi et al., 2000)
 
有益作用如改善抗老化抵抗力,通过在棉花纤维加入小量细菌纤维素来达到,能得到手工制作纸,用于古老文档修复。这纸张显示适宜墨水承受力和特定撕扯(Krystynowicz et al., 1997)。这纸含有1%细菌纤维素就能满足对信息和文件纸
国际标准ISO 9706:1994,特定撕扯可与抹布纸相比。可能用细菌纤维素加压制模,及用作电绝缘材料的板纸生产和封皮。
 
细菌纤维素还能用于特殊纸张的表面包覆。为此,细菌纤维素过滤悬液(匀质并与其它成分混合)被加入,应用一特殊涂抹器,或是里面是湿板结构,或是部分或全部是干燥板。包被改善性质如光泽、亮度、平滑、多孔性、墨水承受性、和张力。其它添加剂像淀粉、有机聚合物、包括羧甲基纤维素、有机、或是无机色素也可应用。Johnson and Neogi (1989)声称用3%细菌纤维素(固体物质)包被的纸显示有光泽性能和表明强度与有20%传统涂层的影印纸类似。该作者还叙述用细菌纤维素和羧甲基纤维素做包被甚至有更好特性,因为它们有协同作用。
 
细菌纤维素也是合成纸的重要成分(Iguchi et al., 2000),自无极性聚丙烯和聚乙烯纤维,提供绝缘、耐热和阻燃特性,不能形成氢键。这型纸的木浆量通常是20-50%达到优良质量。应用细菌纤维素能使添加剂的量减少而对合成纸特性没有任何影响。
细菌纤维素在无纺布样产品也表明是良好粘合剂(Yamanaka et al., 1990)通常用于外科洞巾和大褂并含有各种亲水和疏水性、天然和人造纤维,像纤维素酯、聚烯烃、尼龙、有机玻璃、或是金属纤维。甚至小量细菌纤维素就能改善织物拉力和撕扯强度,例如,10%细菌聚合物相当于20-30%乳剂粘合剂。
 
细菌纤维素应用范围可以更广泛,因为它在合成期间是可变化的(Brown, 1989a,
1989b)。为此,羧甲基纤维素或是糖类共聚物和草酸可以直接加入到培养基中(Yamanaka et al., 1989)。有羧甲基纤维素存在得到的纤维素并有有机溶剂干燥有弹性和伸缩力特征及更高容水力(更快吸收更多的水)。最佳羧甲基纤维素浓度范围从0.1 to 5% (w/v)。有机溶剂的极性也能影响细菌纤维素的特性。用丙酮处理聚合物之后有弹性和橡胶样,而用无水乙醇干燥之后细菌纤维素像皮革。
因为细菌纤维素对酶消化敏感,被改变会得到各种满意生物降解力和强度的复合材料。这些产品的产生是根据纤维素和共聚物或是在含共聚物培养基中培养能产生细菌纤维素菌株之间的化学反应来决定的。
 
11.2.医学应用
从静止培养得到的纤维素膜片是容易应用的,是天然“编织”创伤敷料,适合现代创伤敷料标准(Figure 16)。它是可灭菌、生物相容性、多孔、有弹性、容易操作和贮存、吸附分泌物、提供最佳湿度,这些都是创伤快速康复、防止次生感染和机械损伤、不会粘附新生组织、烧伤热吸附可缓解疼痛的重要因素。细菌纤维素片对固定加速康复过程的药剂也是极好的载体。
16。纤维素膜片是创伤敷料的材料
 
因为细菌纤维素能有各种大小,它相对容易生产对于广泛创伤的敷料。因为近来动物源产品、胶原敷料的问题,可由细菌纤维素之一取代。这论点受到临床试验真实肯定结果额外支持。例如,细菌纤维素制剂Prima Cel,由Xylos公司生产,按美国伦斯勒理工学院在治疗溃疡临床试验用作创伤敷料。得到的结果是满意的,8周之后有54%病人恢复和其余溃疡也都痊愈(Jonas and Farah, 1998)
生物敷料
 
A. xylinum纤维素的其它商业产品,像Biofil表明作为皮肤移植物和三度烧伤治疗、溃疡、发现在恢复牙周和褥疮应用是极好的。另一制剂,Gengiflex 薄织物(Jonas and Farah, 1998)Krystynowicz 等人(2000)A. xylinum纤维素制备薄膜调查指出( 17)作为创伤敷料一般应用是可能的。
17。应用细菌纤维素敷料治疗烧伤,康复之前(a)和之后(b) (Krystynowicz
et al., 2000).
      
细菌纤维素中空管纤维用作人造血管和输尿管研究结果是有希望的(Yamanaka et al., 1990)。细菌纤维素的抗凝血特性(血液相容性)通过根据在成年狗血管(部分降主动脉和颈静脉)用细菌纤维素制造人造对应物更换的试验做出了评价。一个月之后人造脉管被取出并检查它的内表面血栓粘附状态。细菌纤维素血管保持很好的开通状态。
另一成功试验表明应用生物合成纤维素更换狗硬脑膜材料(Jonas and Farah, 1998)
 
因为它的高拉力强度、弹性、对液体和气体的可渗透性、干燥细菌纤维素用作生物传感器中附加膜保护固定的葡萄糖氧化酶,用以测定血液葡萄糖水平。这细菌纤维素膜在10倍稀释人血溶液可增强电极稳定性至200小时。其它商品保护膜,像cuprophan(AKZO, England),只提供电极稳定性30小时。在未稀释人血用cuprophan覆被的生物传感器稳定3-4小时。而细菌纤维素膜稳定性延长至24小时。
 
11.3.食品应用
化学纯和可代谢惰性细菌纤维素已在食品加工中用作非卡如里膨胀和稳定剂。和植物多糖及其衍生物的纯制剂相似,它是用作泡沫、胶质和淀粉凝胶、乳胶的稳定作用,即罐装巧克力饮料和高汤、质感改变,即,果浆稠度改善、粘度增强、脂类取代,包括油类,和饮食纤维补充剂(Ang and Miller, 1991; Kent et al., 1991; Krystynowicz et al., 1999)
 
 
细菌纤维素在食品生产首次成功商业应用是“nata de coco(椰果) (Sutherland, 1998)。是菲律宾传统甜食,是从椰乳或含蔗糖的椰水制备的,适合产生细菌纤维素细菌的生长培养基。食用菌膜能保护抵抗结肠癌、动脉粥样硬化、冠状动脉栓塞和防止尿中葡萄糖突然升高。因此椰果在亚洲以外也是越来越受到欢迎。
另一种受到欢迎的含细菌纤维素食品是中国康普茶(茶格瓦斯或茶菇),在茶和糖液中生长的酵母和醋酸菌得到。在表面形成的膜片含有对人体有益健康的纤维素和酶。它们的非生物活性对大肠和整个消化道有特殊刺激。康普茶对某些癌症有保护(Iguchi et al., 2000)
 
由一些作者提出的研究结果,应用由A. xylinum合成的细菌纤维素膜片对葡萄酒和果汁滤过液,及多酚固定是有希望的(Krystynowicz et al., 1999)。生物活性花青素制剂,在饮食纤维中被浓缩,对功能食品是很好的。细菌纤维素还表明在面包产品中是有吸引力成分,因为它起着饮食纤维的作用,保留味道和气味并延长贮存期。
 
11.4.其它应用
它有大的可触及的表面区、高度坚固、和超级吸附特性及通过物理或化学方法改变的可能性、这意味着细菌纤维素能用于生物催化剂固定载体。含有固定动物细胞的纤维素凝胶用于培养产生干扰素、白细胞介素-1、细胞抑制剂和单克隆抗体(Iguchi et al., 2000)。细菌纤维素还用于Gluconobacter oxydans(氧化葡萄糖杆菌), AcetobacterMethanolyticus(醋酸菌)Saccharomyces cerevisiae(啤酒酵母)细胞的吸附。固定菌株表明各自是葡糖酸盐(收量84–92%)、二羟基丙酮(收量90–98%)和乙醇(收量88–92%)的有效产生菌,和表现很好操作和热稳定性。
 
纯化细菌纤维素可以是醋酸纤维素、硝化纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、甲基纤维素和羟基纤维素的合成原料(Yamanaka, 1990)。即使细菌纤维素是在有混合物存在产生的,受规律原纤维组装干扰和影响β-1,4-葡聚糖结构,例如羧甲基纤维素或其它纤维素衍生物,和其它碳水化合物(淀粉、葡聚糖)、硫酸盐和烃基磷酸盐、产生微生物聚合物是新奇的、添加剂-依赖和有益特性,包括光学透明或更高水结合能力,甚至重复浸湿和干燥之后。细菌纤维素在化学、造纸和纺织工业的潜在应用是根据它价格和易取性。为适合这些需求,细菌纤维素必定是由高效菌株产生、是生长在廉价培养基中、在复杂表面、固态或深层发酵(Vandamme et al., 1998)
 
12.专利
对细菌纤维素的兴趣快速增长,反应在专利数量上(自1980年以来,每年大约有20件)和这种独特聚合物的专门出版物(近10年每年20-40本)(Iguchi et al., 2000)。某些关于细菌纤维素生物合成、特性和应用专利见表4.这些专利在章节中引用和在参考中列出。
13.前景与展望
115年前(Brown, 1886)报道第一篇科学论文是在许多国家“醋厂”(Yamanaka et al., 1989)许多年就知道由醋酸菌形成一种特殊物质。进一步研究发现这种物质就是超纯纤维素。多糖生物合成物的代谢路径和复杂分子结构,以及它的迷人动力学初期链条联想到一种具有独特性质结构已有阐述。即使细菌纤维素进展和有限商业化必定发生,但相关生物技术、与现代工业对植物纤维素技术的竞争,尚未开发。
那么,怎样做才能使细菌纤维素生产达到成功并实现商业化?首先, 必须创建稳定超额生产聚合物菌株,应用分子遗传学和生物学新近成就。这些菌株必须能吸收广泛碳源并显示朝着自然突变向细胞突变是低倾向并在搅拌培养条件下能有效合成纤维素(10–15 g Ld)。新的静止和深层培养生物反应器的建造是必然的。
细菌纤维素生产成本要明显降低,用富含适宜碳源的工业废料取代昂贵营养培养基来获得、像结晶葡萄糖生产的废液等。同时,应该得到重要环境效益。然而,细菌纤维素大量生产的重要优势应该是对森林的保护,目前是在以惊人的速度在消失,因此导致土壤富营养化(污染灾害)和全球气候改变。
细菌纤维素早已具有多种用途,在回顾中提出。这种多糖不仅能取代某些动物聚合物(胶原)而且还可以携带对人体健康具有有益影响的物质(即抗氧化剂和益生元)。细菌聚合物在医学的用途(创伤、烧伤和溃疡敷料、移植物成分)已不成问题。而且,纤维素颗粒物能是药剂固定的极佳基质。例如,如果特殊物质(受体)被细菌纤维素吸附,所产生的分子能清除栖息在消化道里的毒素或病原微生物。近来,细菌纤维素独特纳米晶体(30×600–800 nm)商标(Xylos)
选择性地得到,是从它的商品制剂Prima Cel,这些纳米晶体表面的修正物(三甲基硅烷)的衍生物,获得了它剩下的完整核心。这样修正过的晶体在几种先进科技有很大潜能。
破解纤维素生物合成的所有迷津将会导致细菌纤维素超分子结构和特性的剪裁和改善,作为结果,有关它的廉价生产和对它的体积和特殊应用的新奇理念将得以发展。
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细菌纤维素
作者:Stanislaw Bielecki
20051
 
目录
摘要
1.前言
2.历史概述
3.细菌纤维素结构
4.化学分析和测定
5.产生菌
6.生理功能
7.细菌纤维素的生物合成
8.细菌纤维素的生物降解
9.生物技术生产
10.特性
11.应用
12.专利
13.展望和远景
参考
缩写
主题
 
1.前言
2.历史概述
3.细菌纤维素的结构
4.化学分析和测定
5产生菌
6.生理功能
7.细菌纤维素生物合成
7.1.纤维素前体合成
7.2.纤维素合成酶
7.3.生物合成机制
7.4.纤维素生物合成的基因基础
7.5.细菌纤维素合成控制
7.6.由A. xylinum的可溶多糖合成
7.7.由A. xylinum合成的细胞内和细胞外纤维素的作用
8.细菌纤维素的生物降解
9.生物技术生产
9.1.天然源分离和细菌纤维素产生菌株改进
9.2.发酵生产
9.3.体外生物合成
9.4.化学—酶合成
9.5.预期在未来应用的生产工艺
9.6.回收和提纯
10.特性
11.应用
11.1.科技应用
11.2.医学应用
11.3.食品应用
11.4.其它应用
12.专利
13.展望和前景
 
 
1.前言
纤维素是地球上最丰富的生物聚合物,公认是植物界的主要成分,但也代表微生物细胞外聚合物。细菌纤维素(BC)属于基础代谢的特殊产物并且是一种保护包被,而植物纤维素(PC)起着结构作用。
由细菌合成的纤维素是属于醋酸菌属(Acetobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和八叠球菌属(Sarcina(Jonas and Farah, 1998)。最有效的生产菌是革兰氏阴性、醋酸菌Acetobacter xylinum(重新分类为Gluconacetobacter xylinus, Yamada et al., 1997; Yamada, 2000),用于微生物基础和纤维素研究(Cannon and Anderson, 1991)
研究集中在生物聚合物合成机制及决定它实际应用的机构和特性(Legge, 1990; Ross et al., 1991)。细菌纤维素最重要特性之一是它的化学纯度,是它与通常伴有去除特别困难半纤维素和木质素的植物纤维素的区别。
因为这独特性质,是从超细网状结构产生的,因此,细菌纤维素发现在造纸、纺织品和食品工业以及在化妆品和医药中的生物材料的诸多应用(Ring et al., 1986)。这种多糖的广泛应用显然是根据生产规模及其价值决定的。因此,基础研究和菌株改良和生产工艺开发加强研究同时进行。
 
2.历史概述
1886年由A. J. Brown首次报道A. xylinum细胞外胶膜合成,细菌纤维素在20世纪后半期引起更大关注。Hestrin 等人(1947, 1954)开始应用A. xylinum作为模型菌集中研究细菌纤维素合成,证明休眠和冻干醋酸菌细胞在有葡萄糖和氧存在可以合成纤维素。随后Colvin (1957)在含无A. xylinum细胞提取物、葡萄糖和ATP的样品测到纤维素合成。在细菌纤维素合成研究的里程碑,在这评论中提出,不仅是细菌聚合物的生物起源,而且还有对植物所做的贡献,导致了在自然界最重要进程之一的了解。
真实的历史概述提出贯穿下面所有章节,包括参考。
 
3.细菌纤维素结构
在细菌纤维素广泛研究,细菌纤维素的化学性与植物纤维素一致,揭示纤维素是β—1,4无支链聚合物连接吡喃葡萄糖残余,但它的大分子结构和特性与后者不同(图1)细菌纤维素初生链聚集形成亚原纤维,宽约1.5 nm和薄的自然发生的纤维,只相当于某些植物形成层中和奎宁粘液中检测到的纤维素次级纤维。细菌纤维素亚纤维被结晶进入微纤维(Jonas Farah, 1998)。这些成束和之后成带(Yamanaka et al., 2000)。按Zaar (1977)带的大小是3–4 ()×70–80 nm (),Brown et al. (1976)3.2×133 nm,或按Yamanaka 等人. (2000),4.1×117 nm,而桦树或松树桨产生纤维素纤维宽度是两个数量级2–2和各为3.0–7.5×10 mm,微生物超细丝带更大1.4–4.0×10纤维素,它的长的范围1 to 9 µm,形成一
稠密网状结构(Figure 2),结合大量的氢来稳定(Figure 3)。细菌纤维素与它的培养对应物也有区别,在高结晶指数(60%以上)和不同的聚合程度,通常在2000 6000之间,(Jonas and Farah, 1998),但在某些情况甚至可达到16,000 20,000之间 (Watanabe et al., 1998b),而培养聚合物的平均聚合程度变化从13,000 t14,000 (Teeri, 1997)
 
1.植物纤维素“边饰微粒”纤维与细菌纤维素微纤维比较模式图(Iguchi et al., 2000; with kind permission)
2.静止培养A. xylinum得到的细菌纤维素膜扫描电子显微镜图像(a)和附着在纤维素带的细菌细胞(b
3.在纤维素中链外(a)和链内(b)氢键。
A. xylinum
细菌纤维素肉眼形态完全根据培养条件而定(Watanabe et al., 1998a;Yamanaka et al., 2000)。在静止条件下(图4)细菌积聚纤维素膜(S-BC)出现在营养培养基表面,是在氧气丰富的气液界面。纤维素亚纤维,在细菌细胞表面从直线序孔连续伸出、结晶成微纤维并强行深入生长培养基中。因此,皮革样薄膜供养A. xylinum细胞群,由重叠和绞合纤维素带组成,形成平行有秩平面(Jonas and Farah, 1998)
静止培养细菌纤维素临近索支和互相连接比搅拌培养产生的细菌纤维素更少、在一型不规律颗粒、星形和纤维索、在培养基中很好分散(图5(Vandamme et al., 1998)。在搅拌细菌纤维素网状索相互连接形成网格模式,并有粗略垂直和粗略平行定位(Vandamme et al., 1998)
4.在静止培养中形成的细菌纤维素膜。
5.在搅拌培养中形成的细菌纤维素小球。
搅拌纤维素和静止纤维素在三维结构之差异在扫描电子显微镜显而易见。静止纤维素纤维有更大扩展和一个交叉堆积在另一个上面。搅拌纤维素索被缠绕和弯曲(Johnson and Neogi, 1989)
此外,它们有更大横截面比静止纤维素纤维宽(0.1–0.2 µm)(通常是0.05–0.10 µm)。静止纤维素和搅拌纤维素之间的形态差异致使结晶度数不同、不同晶粒大小和纤维素I容量。
纤维素有两种常见结晶型,定为I II,由X光、核磁共振(NMR)、拉曼光谱和红外线分析来区别(Johnson Neogi, 1989)。已知在相对稳定纤维素I,多是由植物也可以由静止培养的A. xylinum合成,平行β-1,4-葡聚糖链是单向排列,而纤维素IIβ-1,4-葡聚糖链排列随意方式。它们多是反平行的并有大量氢键链接,这结果是使纤维素II有更高热稳定性。
搅拌细菌纤维素比静止细菌纤维素有更低结晶度指数和结晶更小(Watanabe et al.,1998a)。还注意到,在搅拌培养中合成的细菌纤维素发生大部分是纤维素II。在自然界,纤维素II只有几种生物合成(某些海藻、霉菌和细菌,像胃八叠球菌(Sarcina ventriculi))(Jonas and Farah, 1998);这种纤维素的工业生产是根据植物纤维素化学转换。
C-NMR(核磁共振)有可能揭示纤维素I的存在和I的两个独特的纤维素型(Watanabe et al., 1998a)。这些型发生在海藻、细菌和植物衍生的纤维素中。后者比细菌纤维素含有更少纤维素I(Johnson and Neogi, 1989)
纤维素I不可逆晶体转变到I改变X线和CP/MASC-NMR(核磁共振)光谱是因为在单元细胞中的差异。静止细菌纤维素比搅拌细菌纤维素含有更多纤维素I。已报道在搅拌细菌纤维素和静止细菌纤维素之间纤维素I的差异超过结晶度指数(Watanabe et al., 1998a),和大部分纤维素I是与晶体大小密切相关。
 
4.化学分析和测定
为了测定纤维素的结晶或非晶态,有几种直接染色用于线状β-1,4-葡聚糖是特异性的(Mondal and Kai, 2000)。都是荧光增白剂并形成色素-纤维素复合物,由范德华和/或氢键合来稳定。
这些染料之一是荧光增白剂卡尔科弗卢尔(Calcofluor)。这种直接染料不仅能使纤维素链可视,而且还能广泛用于初生纤维素链联合和结晶化研究(见章节7.3.2)
纤维素平均重量DPDP分布是用硝化纤维素样品通过高性能凝胶渗透来测定的(Watanabe et al., 1998a)
在搅拌培养条件下产生的微生物纤维素的网状结构和在静止培养形成的纤维素膜有条理分层结构之间的区别,在扫描电子显微镜图像显而易见(Johnson and Neogi, 1989)
为了区分来自纤维素II反平行之一的纤维素I平行链结晶格,可应用X线衍射、拉曼光谱、红外线分析和核磁共振(Johnson and Neogi, 1989)。结晶度指数和结晶大小是根据X线衍射测量值来计算的(Watanabe et al., 1998a)。纤维素I有两个独特型,即纤维素IIX线衍射不能区分、因此CP/MAS核磁共振分析,在冻干纤维素样品进行,对这大量组分进行判断(Watanabe et al., 1998a)
纤维素的理化特性像容水能力、分解纤维素悬液的粘度和干膜Young's系数是应用常规方法测定的(Watanabe et al., 1998a, Iguchi et al., 2000)
 
5.产生菌
细菌纤维素是由几个菌属合成的,其中醋酸菌株(Acetobacter)最著名。纤维素生产菌概述见表1. (Jonas and Farah, 1998)。聚合物的结构是根据微生物而定的,虽然它的生物合成路径和它的调节机制在大部分细菌纤维素产生细菌可能是共同的(Ross et al., 1991;Jonas and Farah, 1998)
Table 1. BC producers (Jonas and Farah, 1998, modified)
GenusCellulose structure
Acetobacte rextracellular pellicle composed of ribbons
Achromobacter fibrils
1.细菌纤维素产生菌(Jonas and Farah, 1998, modified)
菌属                纤维素结构
醋酸菌属(Acetobacte          胞外丝带组成薄膜
无色菌属(Achromobacter      原纤维
气杆菌属(Aerobacter          原纤维
土壤杆菌属(Agrobacterium     短小纤维
产碱杆菌属(Alcaligenes        原纤维
假单胞菌属(Pseudomonas      不明显小纤维
根瘤菌属(Rhizobium           短小纤维
八叠球菌属(Sarcina            无定型纤维素
动胶菌属(Zoogloea            尚未确定
A. xylinum(同义词A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus),是纤维素最有效产生菌,近来重新分类并包括在新奇菌属葡糖酸醋酸菌属(Gluconacetobacter)中,木葡萄酸醋杆菌(G. xylinus(Yamada et al., 1998, 2000)和某些其它菌属((G. hansenii, ropaeus, G. oboediens, and G. intermedius).)一起。
 
6.生理功能
在自然栖息地,大部分细菌合成胞外多糖,在细胞周围形成包封(Costeron,1999)。细菌纤维素就是这样物质的一个例子。纤维素产生菌的细胞包封在聚合物网络之中,常常在液-气界面维持群聚(Wiliams and Cannon, 1989)。因此,细菌纤维素形成菌株能栖息在污水中(Jonas and Farah, 1998)。聚合物基质使部分细胞粘附于任何可接近的表面并促使营养提供,因为它们在聚合物格架中浓集,与周围水环境相比,由于它的吸附特性而明显增强(Jonas and Farah, 1998; Costeron, 1999)。某些作者设想,由A. xylinum合成的纤维素也可以起储存作用并能被饥饿微生物利用。它的分解是由外和内葡聚糖酶催化的,这种联合存在,在某些产生纤维素A. xylinum菌株的培养基中被检测到(Okamoto et al., 1994)
因为纤维素层的粘度和亲水特性,使产生的细菌在栖息地对不利变化(水容量减少、pH变化、毒性物质、病原微生物的存在、等)抵抗增强,并且它们在包膜内能进一步生长和发育。还发现细菌周围的纤维素使它们对紫外光的照射得以保护。在紫外光照射1小时处理,还有多达23%的醋酸菌细胞因为受细菌纤维素包裹而活存。如果去除保护多糖将使它们的活性急剧降低(只有3%(Ross
et al., 1991)
 
7.细菌纤维素的生物合成
细菌纤维素的合成是精确和特异控制的多-步骤过程,涉及大量独特的酶和催化及调控蛋白复合物,其超分子结构迄今尚未明确界定。这些过程包括尿苷二磷酸葡萄糖(UDPGlc)合成,这是纤维素的前体,随后是葡萄糖聚合成β-1,4-葡聚糖链,和这初生链联合特征的带样结构,由数百或数千个别纤维素链构成。
UDPGlc合成的路径和机制已明确了解,而葡萄糖聚合成大的和无支链、它从细胞内挤出及自行组装成原纤维的分子机制,需要进一步阐述。
而且,细菌纤维素合成研究会有助于更好了解植物纤维素的生物起源。
7.1.纤维素前体的合成
A. xylinum的纤维素合成是碳代谢的最终产物,取决于细胞介入戊糖磷酸盐循环或克雷布斯循环的生理状态、与糖异生耦合(6) (Ross et al., 1991; Tonouchi et al., 1996)糖酵解在醋酸菌不起作用,因为它们磷酸果糖激酶路径不能合成这重要酶(EC 2.7.1.56) (Ross et al., 1991)。在A. xylinum纤维素合成是与氧化分解过程密切相关并消耗异化反应衍生的多达10%能量(Weinhouse, 1977)。细菌纤维素产生不受其它同化过程包括蛋白合成的干扰(Ross et al., 1991)
6.A. xylinum碳代谢路径。CS,纤维素合成(EC2.4.2.12),FBP,果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.11)GK,葡糖激酶(EC 2.7.1.2); G6PDH,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49); 1PFK,果糖-1-磷酸盐激酶(EC 2.7.1.56); PGI,磷酸葡萄糖异构酶;PMG, UDPGlc磷酸葡萄糖变位酶(EC 5.3.1.9); PTS,磷酸转移酶系统;UGP,焦磷酸化酶(EC 2.7.7.9); Fru-bi-P,果糖-1,6--磷酸盐;Fru-6-P,果糖-6-磷酸盐;Glc-6(1)-P,葡萄糖-6(1)-磷酸盐;PGA,磷酸葡糖酸;UDPGlc,尿苷二磷酸葡萄糖。
A. xylinum能转换各种碳化合物,如已糖、甘油、二羟基丙酮、丙酮酸和二羧酸成为纤维素,通常有效率50%。后面化合物进入克雷布斯循环并由于草酸盐脱羧成丙酮酸盐经过糖异生转换到已糖,与甘油、二羟基丙酮类似,并且是戊糖磷酸循环的间体(图6
纤维素直接前体是UDPGlc,是一种常规路径的产物,常见于包括植物的很多生物,并涉及葡萄糖磷酸化到葡萄糖-6-磷酸盐(Glc-6-P),由葡糖激酶催化,接之这间体向Glc-α-1-P,异构化,由磷酸葡糖酸变位酶催化并且后面代谢物由UDPGlc焦磷酸化酶转化到UDPGlc。这最后的酶似在纤维素合成中介入重要酶之一,因为某些表型纤维素阴性突变物(Cel),特别缺乏这种酶(Valla et al., 1989),虽然它们表现有纤维素合成(CS)活性,纤维素合成的观察方法经过体外证实,Cel株无细胞提取物来催化(Saxena et al., 1989)。此外,不同A. xylinum菌株之间焦磷酸化酶活性有变化并且在最有效纤维素产生菌测定有最高活性,如A. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001。这后者菌株喜欢果糖作碳源,磷酸葡萄糖异构酶表现高活性,并且具有依赖磷酸烯醇丙酮酸盐磷酸转移酶系统。这系统刺激果糖向果糖-1-磷酸盐转换并促进果糖-16-二磷酸盐(图6
7.2.纤维素合成酶
纤维素在植物和原核生物的生物合成是由尿苷二磷酸盐(UDP)-形成CS催化的,主要是处置4-β-糖基转移酶(EC 2.4.1.12, UDPGlc: 1,4-β-葡聚糖4-β-D-葡萄基转移酶),因为它从UDPGlc向新形成多糖链连续输送吡喃葡萄糖残余物并所有时间都与这链连接。低聚CS复合物常被叫作末端复合物(TCs)。它被假设,TCs首先负责β-1,4-葡聚糖链合成,通过外膜挤出(如果是球状,CS催化域是定位在细胞膜的胞浆侧),并联合和晶体化为明确的超分子结构,跟随头两个过程。
A. xylinum纤维素合成是典型膜-固定蛋白,分子量400–500 kDa (Lin and Brown, 1989),并于胞浆膜紧密结合。
因为这个定位,CS纯化是非常困难的并且膜组分的分离必须在CS溶解和纯化之前进行。
而且,A.xylinum CS表明是一种很不稳定的蛋白(Lin and Brown, 1989)。从膜分离CS是应用洋地黄皂甙(Lin and Brown, 1989)或是洗涤剂(Triton X-100)进行的并用胰蛋白酶处理(Saxena et al., 1989),接之在纤维素中截留CS
按照Lin and Brown (1989)所述,纯化CS制剂在三种不同型亚单位中含有,分子量在90, 67, and 54 kDaSaxena et al. (1989)发现只有两型多肽(83 and 93 kDa).。这后面结果似更可信,因为这两个亚单位大小与Saxena et al. (1990b, 1991)CS操纵子测定的两个基因cesA cesB的大小及由Wong et al. (1990) and Ben-Bassat et al. (1993)对同样操纵子(see Section 7.4).报道的基因bcsA bcsB是相符的。
光化学亲和研究指出83-kDa多肽是一种催化亚单位,显示有高亲和力倾向UDPGlc (Lin et al., 1990)。根据基因序列,它含有723氨基酸残基,多是疏水的。这亚单位可能合成蛋白原,含有单一序列,由24个氨基酸残基组成,在制造加工期间截断(Wong et al., 1990)。成熟蛋白是靠近多肽链的N-末端以跨膜螺旋方式在细胞膜固定的。蛋白含有5个以上跨膜螺旋线,能相互和与在细胞质中潜入球型区域组成的一大的催化位点相作用。
Brown and Saxena (2000)主张A. xylinum CS的催化亚单位以同样方式操作次系加工糖基转移酶,即它在纤维素催化配糖直接结合合成,在异头碳构型同时反转来协助,来自UDPGlcα-构型,对多糖β-构型是单体供体。催活天冬氨酸残基(D),和在许多加工糖基转移酶的球形碎片中发现短序列DXD QXXRW
(Saxena and Brown, 1997)。在A. xylinumCS测到同样运动。在许多配糖合酶这球形碎片有两个区域特征(即由两个区域AB组成)(Saxena et al., 1995)A区包括D残基,是催化作用的关键,和DXD运动,这可能是结合核苷-糖的底物。
BrownSaxena (2000)近来证实由A. xylinum CSUDPGlc结合中这运动的参与,研究应用位点定向诱变得到酶突变。迄今尚不清楚A. xylinum CS的球形碎片是由一个还是两个域组成,虽然这第二种可能性更大。然而,已知A. xylinum CS催化亚单位是糖基化的。糖基化的两个可能位点在其原发结构中发现,是根据基因排序推测的(Saxena et al., 1990a)
93-kDa多肽与催化亚单位紧密结合。它含有单一序列靠近它的N-终端和一个跨膜螺旋靠近C-终端。这螺旋能固定在细胞膜。多肽可能是一个调控亚单位,与CS活化剂-环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)相互作用(7.5)93-kDa多肽不与93-kDa亚单位抗体结合。但是,尚不清楚CS是不是只由两个亚单位组成,因为这低聚复合物有多种作用,即β-1,4-葡聚糖聚合作用,细胞外亚纤维挤出,及纤维素带自身组装和晶体化,由微纤维组成。因此,CS复合物可能包括在跨膜孔形成中涉及的其它多肽中。纯净CS显微镜图分析表明酶倾向形成四聚物或八聚物(Lin et al., 1989)
 
7.3.生物合成机制
亚稳定纤维素I同质异形的合成,在A. xylinum和其它纤维素-产生生物,包括植物,至少涉及两个中间步骤,即(1)葡萄糖分子向线形1,4-β-葡聚糖的聚合和(2)单一初始聚合链向超分子结构的组装和晶体化,每种纤维素-产生生物的特征。假设CS球域是定位在细胞膜细胞质一侧(see Section 7.2),还需要1,4-β-葡聚糖链通过膜转移到细胞外。所有这三个步骤是紧密相连的,并且聚合速率是受组装和晶体化速度限制的。
 
7.3.11,4-β-葡聚糖聚合机制
细菌纤维素的形成是在A. xylinum胞质膜通过CS复合物催化结成直线。因为这些复合物能聚合成200,000分子量的Glc s成为β-1,4-葡聚糖链(Ross et al., 1991),这过程必须是高强度运行的。这反应机制迄今尚未明确。最近,对在A. xylinum机制提出两个不同的假想。
其一,是在Brown实验室提出的(Brown, 1996; Brown and Saxena, 2000),假设1,4-β-葡聚糖聚合不涉及一脂间体,从UDPGlc把葡萄糖转移到新合成聚合物链。这假设与为无支链同多糖合成负责的糖基转移酶是加工酶的事实一致。1,4-β-葡聚糖聚合图示,由Brown及其同事提出,见图7
7。对聚合反应的一般概念导致β-1,4-葡聚糖链生物合成(Brown Saxena, 2000;
按这个模式,与其它加工糖基转移酶相似,CS催化亚单位的球形碎片中有3个催化位点。催化位点之一(2a),由DXD基序结合两个UDPGlc分子组成(见图7.1)第二个催化位点(1a),包括重要天冬氨酸(D)残基,在隐袋中催化形成两个Glc残基之间β-1,4-连接(见图7.2),伴随相关的两个UDP分子。第三个位点(3a),含有QXXRW基序,牵拉合成纤维二糖还原端(见图7.3)。二糖遗留区1a–2a,可以结合两个后续UDPGlc分子(见图7.4)并形成次级纤维二糖分子。接下来,涉及QXXRW基序,这第一个纤维二糖分子还原端,被迫向挤出位置。同时,次级纤维二糖分子与(位点1aD残基的协助)初始非还原端结合,得到纤维四糖。被清除的1a–2a区可以结合两个后续UDPGlc分子,去重复反应循环,在链上附着两个以上葡萄糖残基。这聚合作用模式简化表见图8
按这模式,新合成β-1,4-葡聚糖链开始形成它的还原端挤出。
8.Brown模型细菌纤维素生物合成简化表(Brown Saxena, 2000)。
Koyama等人(1997)研究证实了这模型。作者证明葡萄糖残基是附加于多糖非还原端的,初生聚合链还原端位置是远离细胞的。而且,在纤维素分子中两个邻近葡萄糖残基之间是扭曲角是180°,在生长链附加纤维二糖残基(而不是单一葡萄糖部分有助于维护)β-1,4-葡聚糖双重螺旋轴(Brown, 1996)。还有Kuga Brown (1988),应用银标记,证明纤维素从它的还原端开始链被挤出细胞外。
Han and Robyt (1998)应用A. xylinum ATCC 10821株研究了细菌纤维素合成(静止C跳动并与D-葡萄糖和细胞和膜制备追逐反应)应用UDPGlc,分别提出额外的,程序不同分子机制。他们认为活化的葡糖吡喃糖(来自UDPGlc)连贯残基被联接到生长纤维素链的还原端,因为得到从纤维素链挤出还原端的D-[C]葡糖醇与D-[C]葡糖醇的比率是随时间而减少的。Han Robyt假定脂焦磷酸盐和类萜特性是生物合成部分。按他们的观点,在细菌纤维素合成期间脂间体的形成由脉冲C标记和氯仿和甲醇混合物提取物多达33%来证实。它的定量提取是不可能的,因为当多糖链长超过8–10糖部分,含脂复合物在提取混合物中变得不能溶解。
Han Robyt提出,细菌纤维素生物合成在胞浆膜涉及三种酶嵌入:CS,焦磷酸脂:UDPGlc磷酸转移酶(LipPP:UDPGlc-PT),和焦磷酸脂磷酸水解酶(LPP)。其反应机制作者称为嵌入反应,在图9提出。
9。细菌纤维素合成机制涉及脂间体(Han and Robyt, 1998; )Lip、脂;P.磷酸;RibD-核糖;U,尿苷;葡糖残基;LP: UDPGPT,焦磷酸脂;CS;纤维素合成酶;LPP,焦磷酸脂磷酸水解酶。
这第一种酶从UDPGlc转移Glc-α-1-P到单磷酸酯(Lip-P),这样就得到焦磷酸脂-α-D-Glc (LipPP-α-Glc)(9反应1)。在端基碳α结构涉及Glc磷酸酯结合,与基底分子的残留相同。这反应的次级产物是UMP(按Brown氏模型UDP释放)。
接下来的反应(反应2,图9),由CS催化,葡萄糖残基从一LipPP-α-Glc分子转成另外一种和两个葡萄糖残基之间形成β-1,4-糖苷连接,由于它们之一C-4羟基组附着在次级葡萄糖(来自次级LipPP-α-GlcC-1羟基组。
在第三个反应(反应3,图9),在前步发生形成焦磷酸脂的水解和另外从UDPGlc得到的Glc-α-1P能附着于在这反应中释放的LipP。这3个反应循环连续得到一适宜长度β-1,4-葡聚糖链。这机制包括从一葡萄糖残基LipPP-α-Glc分子的端基碳结构转移从一LipPP-α-Glc分子到另外一种,或是到纤维二糖、丙糖、四糖,和随后到n-糖。一β-1,4-葡聚糖长链的受体,始终是单一α-D-葡萄糖残基,于聚合系统中存在的两个LipPP分子中的一个相连接。这意味着,来自位于远离细胞的初始纤维素链的还原端和非还原端的链发生延长,这与Brown模型是相矛盾的。按Han Robyt氏模型两者之间有两个协同LipPP分子和CS复合,不是处理糖基转移酶,是植入细菌的胞浆膜。
在纤维素生物合成中脂间体的参与从Agrobacterium tumensefaci(土壤杆菌)(Matthyse et al., 1995)、及Salmonella(沙门氏菌)O-抗原多糖(Bray and Robbins, 1967)Xanthomonas campestris黄单胞菌)胞胶(Ielpi et al.,
1981)得到证实。而且,这脂间体还涉及acetan的合成(DeLannino et al., 1988), 在许多A. xylinum菌株,这是一种与纤维素一起产生的可溶多糖(见7.6段)。为了阐明脂间体在纤维素形成中是否起作用已在深入研究,这是由Han Robyt (1998)提出的假设。相反,Brown氏设想(1996, 2000),由体外纤维素合成已证实,溶解的A. xylinum膜制剂用洋地黄皂苷催化(Linet al., 1985; Bureau Brown, 1987),和通过提纯CS亚单位合成聚合物(Lin Brown, 1989),不包括脂成分。
按照提出的两个假想细菌纤维素合成不需要任何原始物,与早时减免是相一致的(Canale-Parda and Wolfe, 1964)
7.3.2.纤维素链的组装和结晶
吡喃葡萄糖分子到β-1,4-葡聚糖的聚合,无论是什么机制,这是纤维素合成最复杂阶段,在细菌也是如此。纤维素独特的机构和特性,都是源于此。再导致深入阶段:就是链被挤出并在细胞外组装,得到超分子结构。在这些过程中最重要的是细菌纤维素的多聚复合物的特异结构,固定于细胞质膜。在A. xylinum细胞,这些复合物是沿着细胞长轴呈直线排列和一个细胞可容纳50–80植物细胞 (Brown et al., 1976),而在维管植物的组织细胞特征是6重对称花结(Brown and Saxena, 2000)
 
更多地充气,即在A. xylinum培养期间搅拌,或是加入某些物质,它不能渗入细胞内,但能与β-1,4-葡聚糖链竞争氢键(即羧甲基-CM-纤维素,荧光增白剂),能引起纤维素链超分子结构的明显改变,和替代带状聚合物,即相对稳定纤维素I(图10),原纤维与CS复合物同线并集成一行,第二,形成热力更稳定同质异形纤维素II
形成同质异形无定形纤维素II。这现象是组织细胞线性排列紊乱有关。Brown Saxena (2000)对这个问题的论述,这情况取决于最终产物的形态,在胞质膜组织细胞排列起一定作用,虽然他认为与某些藻类相反,A. xylinum这些复合体有稳定特性(Kudlicka, 1989)。值得一提的是在细菌纤维素合成期间A. xylinum细胞运动著名现象,使纤维素链挤出(Brown et al., 1976)A. xylinum细胞的反转运动能计算出典型链伸展率,每小时和每个细菌细胞
,这相当于2 µm 分和相对于8 一聚合物比10个葡萄糖分子成为β-1,4-葡聚糖还要大。如果这强势与亚纤维组装成束或带有关,强到足以转换所有A. xylinum细胞运动,这些力就可以很好影响CS亚单位空间排列,定位在膜的半液体脂双层中。
10. A. xylinum 纤维素亚纤维构造模式:1,脂多糖层,2,壁膜间隙,3,原生质膜,10 nm微粒,CS亚单位(Kudlicka, 1989)
β-1,4-葡聚糖链空间组装有分层特性(10)。在第一步,10-15个初期β-1,4-葡聚糖链形成一个亚单位(也叫原微纤维),直径1.5 nm,不是棒样机构,而是左转三螺旋(Ross et al.,1991)。亚纤维聚集物(扭曲)构成大量平行链组成微纤维。接下来是分层结构,是微纤维束,接下来是松散绕带,大约1000个单独β-1,4-葡聚糖链组成(Haigler, 1985)。在有Calcofluor(荧光增白剂)存在时,渗透进细胞包膜的外膜并与原微纤维形成复合物,它们聚集成微纤维就停止了。在有非常大的分子存在时,像CM-纤维素和木葡聚糖(Yamamoto et al., 1996),非常大穿过膜,装配成微纤维束和带,被分裂,于是表明这后两种结构形成排出纤维。Ross等人(1991), A. xylinum纤维素链结构联合分析,由Bayer (1979)首先报道在细菌细胞中存在,强调在细胞被膜内外膜附着特殊位置的重要作用。它们的发生就能使纤维素微纤维有了出口,不用与任何肽聚糖凝胶的相互作用,它们充满壁膜间隙。它们的相互作用能防止原微纤维之间调整氢结合的形成。
 
分子的孔洞结构,是否能使A. xylinum纤维素微纤维移动通过到细胞外,仍不知晓。属于CS操纵子(见74段)的bcsCbcsD基因表达产物的参与,在它们的形成中不能排除(Wong et al., 1990),这些表达产物表明对纤维素内部合成是越发至关重要(Ben-Bassat 等人., 1993)。还有三种蛋白作用:CSAP20, 54, 59CS-协同蛋白),必须详查。它们与纤维素结合与CS催化亚单位一起,在CS提纯试验中揭示(Benziman Tal, 1995)。可能,导致纤维素合成的复杂机制的其它成分分离和纯化,与A. xylinum CS操纵子的基因直接突变一起,可以有助阐述这些步骤在分子水平发生次序。
初始纤维素链组装过程与亲本A. xylinum细胞密不可分,展示一种独特和显著动力学。这些链的挤出及其组装成有序结构,是通过细胞运动反转辅助的。自始至终,β-1,4-葡聚糖合成和释放全过程,A. xylinum细胞沿着自身轴心转动(伸展运动)(Brown 等人1976)。还有,这运动是由带状物扭曲形式驱动的,停在挤出点,定位在延长细胞侧面。这些扭曲物在电子显微镜下明显可见。
7.4.纤维素生物合成的基因原理
纤维素生物合成涉及几种酶。它们的功能是从指导纤维素前体UDPGlc合成开始的,随后单体聚合。发现初期反应是由葡糖激酶,葡萄糖磷酸变位酶和UDPGlc
焦磷酸化酶催化的,不限制细菌纤维素合成最终速率,因为A. xylinum合成过量UDPGlc (Ben-Bassat 等人., 1993)。细菌纤维素合成速率是由二鸟苷酸环化酶和低聚物,CS调控复合物来控制的。因此,更有效产生纤维素A. xylinum突变株的结构,需要检测对这些酶的基因编码图表。这已由Wong 等人. (1990) Ben-Bassat 等人(1993)研究,已证明,细菌纤维素生物合成涉及4个耦合基因:bcsA (2261 bp), bcsB(2405 bp), bcsC (3956 bp), bcsD (467 bp),形成CS操纵子,长度9217 bp,和同时转录为多顺反子mRNA(信使核糖核酸)。
 
虽然由各基因编码蛋白功能,迄今尚未明确测定,有关其作用的某些信息,已由基因互补试验得出(Wong et al., 1990)。这些研究结果指出,CS-缺陷株能由基因bcsB补充,85-kDa蛋白(802氨基酸残基)指定编码,A. xylinum突变株CS和二鸟苷酸环化酶缺陷,由基因bcsA补充,为84-kDa蛋白(754氨基酸残基)编码(Ben-Bassat et al., 1993)。根据不同的突变株可推断CS复合物和c-di-GMP相互作用在蛋白A 应用部分,是CS异构催化,早期由Saxena 等人假设 (1991)。蛋白B能结合UDPGlc并合成β-1,4-葡聚糖链。催化亚单位(cesA)基因编码与基因bcsB相似(Wong 等人., 1990; Ben-Bassat 等人., 1993),另外Saxena等人描述,一年之后对调控亚单位(cesB).鉴定了基因编码。
但是,Saxena等人(1990a, 1991)推测CS操纵子头两个基因位置是对立的,并且CS催化亚单位是第一个基因编码。在bcsC bcsD 两种基因表达产物的作用,尚未明确测定。这些基因也可能是膜定位蛋白(分别是141 17 kDa)的编码,及在内部纤维素合成和从细胞分泌蛋白两者都是必要的。Ben-Bassat等人(1993)报道,bcsD基因分裂或缺失能明显减少纤维素合成。Saxena等人(1990a)Ross等人(1991)预计在CS操纵子,一些基因存在,能控制纤维素链组装。
还不清楚,在细菌纤维素合成中如果有质粒参与,就是,它能起什么作用。如果能证明,在A. xylinum ATCC 10245 (通常 17005)株的突变物60%质粒检测了组成和大小,是用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍诱变的,它们与野株有明显不同。这些观察提示,质粒结构和细菌纤维素合成之间似有连带关系。
移动的DNA碎片,包括插入序列(IS),特别在原核生物广泛分布,在长750–2500 bp(Galas Chandler, 1989),在许多基因调控是重要因子。ISs可以激活或灭活基因,并且可以启动DNA重新排列,像删除,倒置和整合。表明,ISs 参与Pseudomonas atlantica(假单胞菌属)(Bartlett Silverman, 1989), Xanthomonas campestris (黄单胞菌属)(Hotte 等人., 1990), Zoogloearamigera(粘液菌属)(Easson 等人, 1987).细胞外多糖合成的调控。它也有可能参与细菌纤维素合成的调节。
A. xylinum插入序列已能很好识别IS 1031 (950 bp,和已知核酸序列)。在大多细胞突变株与野株相比测到IS 1031外形改变。某些重组包括两个或更多IS 1031碎片。Coucheron(1991)观察到IS样品有更多明显改变,针对DNA重新排列并设法从灭活基因得到的分裂额外ISs之逆转株和得到假逆转株,在培养基表面产生蜡样物质,但纤维素合成能力不能修复。这些试验指出,有ISs存在有助于A. xylinum.的不稳定性。
 
 
7.5.细菌纤维素合成调节
-3,6:36二鸟苷单磷酸(c-di-GMP, 见图11)A. xylinum CS可逆变构催化剂并且在完整β-1,4葡聚糖生物起源调节起重要作用(Ross 等人1987).
11. c-di-GMP –结构A. xylinum CS.变构催化剂
这化合物与酶调节亚单位结合,并诱生构象改变,促进CS原聚体联合并导致反应增强(Ross等人1987).
A. xylinum细胞中c-di-GMP浓缩是由三种酶调控的:二脒基环化酶(CDG),磷酸二酯酶A (PDEA)和磷酸二酯酶B (PDEB) (12) (Ross 等人1987). PDEA PDEB定位胞质膜,并且CDG有两种形式。
其一是定位胞质膜和另外一个运行于胞质中(Ross et al., 1991)。最近,Weinhouse 等人(1997)报道一新的c-di-GMP-结合蛋白,大概也能参与细胞内游离c-di-GMP浓缩。Tal等人(1998)证明,在A. xylinumc-di-GMP细胞反转是由三个操纵子控制的。
 
12. A. xylinum纤维素合成提出的模型。为简单起见,描述了单一β-1,4-葡聚糖链的合成,虽然CS更复杂形,是同时聚合数个链,在纤维素生物原中或许可激活酶单位(Ross et al., 1991; with kind permission)PDEA,磷酸二酯酶APDEB, 磷酸二酯酶BpppGpG, 二磷酸-di-GMP; pGpG (II), c-di-GMP (cyclic-di-GMP);pGpG, di-GMP (线型 di-GMP).
CDG,A. xylinum纤维素合成系统中的关键调节酶,由两个多肽链和两个基因编码组成(Nichols Singletary, 1998)CDG由镁离子活化和特定受皂素抑制(Ohana 等人1998),是一种糖基化的类萜。CDG转换成两个GTP分子首先进入线型(pppGpG)和然后进入环(c-di-GMP)单磷酸二鸟苷酸,活化CSPDEA分裂物激活c-di-GMP进入线型灭活二聚物(pGpG, di-GMP),PDEB进一步分解成两个5GMP (12)分子。PDEA受钙离子抑制,但不影响PDEB。因此,浓缩物间接影响纤维素合成速率。这些钙离子高浓度能增强这速率,后来c-di-GMP转换非活性线型被抑制。
 
相信CS分子实情是受c-di-GMP激活的及它合成调节涉及CDG正面影响和PDEAPDEB的负面影响,这是其独有特征。迄今,有关纤维素合成调控机制只是在A. xylinum发现
7.6. A. xylinum可溶多糖合成
除了纤维素之外,某些相关可溶多糖也可由A. xylinum合成。
1970年代,测到一种可溶β-匀质葡聚糖。它主要是由β-1,4-链接葡萄糖残基和这链每第三个葡萄糖部分有另外一个葡萄糖亚单位是由β-1,2链接的(Colvin and Leppard, 1977; Colvin et al., 1979)A. xylinum纤维素不形成菌膜(Pel)株合成α-葡聚糖与细胞被膜相连(Dekker 等人1977)Valla Kjosbakken (1981)分离了从培养基中分离到一可溶多糖含Glc, Man, Rha,和葡萄糖醛酸残基(各自克分子比率 3:1:1:1)。所述聚合物由相同部分(改变各自克分子比率6:2:1:1)组成,由另外细胞株合成,是由Minakami 等人测到的 (1984)
这些聚合物某些残基可能被乙酰化(Tayama et al., 1985)
这型多糖常用名乙酰素(acetan(De Lannino 等人1988)
此外,某些A. xylinum野株也能合成类似可溶多糖(Glc, Man,Rha, 葡萄糖醛酸,各自6:1:1:1)和纤维素(Savidge Colvin,1985)
问题是纤维素伴同可溶多糖在其生物合成中起什么作用。看来它不起任何直接作用,即使生物合成动力学与纤维素是相同的(Marx-Figini and Pion, 1974),而且UDPGlc优先用于这些可溶多糖产生代替纤维素产生, (Delmer, 1982)。某些作者叙述内部初始纤维素微纤维,由非晶体物质包裹(Leppard et al., 1975),可由上述可溶多糖组成。在静止培养基液体部分这些可溶聚合物缺失及其纤维素膜存在证实了这个设想(Valla Kjosbakken, 1981).
更早,Ben-Hayyim Ohad1965年揭示,在培养基中存在CM-纤维素,用于细菌纤维素合成,导致纤维素这种可溶衍生物合进聚合物微纤维中。然而,A. xylinum外多糖结合进入纤维素微纤维尚未观察到。
7.7. A. xylinum内和外纤维素酶合成的作用
有关A. xylinum纤维素酶开始报告是由Okamoto 等人 (1994) Standal 等人 (1994),各自发现的,包括对其基因的描述。初期的作者从A.xylinum IFO 3288 DNA基因库选择一个基因为24-kDa蛋白(218个氨基酸残基)编码,显示CM纤维素酶活性。Standal 等人(1994)A. xylinum ATCC 23769细胞突变株发现另外内纤维素酶基因,定位在CS操纵子上部。显示从基因分裂产生纤维素酶合成能力丧失。
Tonouchi 等人 (1997)的结论,研究A. xylinumBPR 2001 -1,4-β-葡聚糖酶基因的定位,是相似的。这后者基因是定位在CS操纵子上部,而第二个纤维素分解酶基因,是由这菌株产生的,即外-1,4-β-葡糖苷酶,在这操纵子下部发现。
A. xylinum BPR 2001--纤维素酶已被提纯和描述特征(Oikawa 等人
1997; Tahara 等人, 1998)Tahara等人研究(1997)还报道,pH 5.0是细菌生长和细菌纤维素合成的最佳条件,两种细菌纤维素酶活性比在pH 4.0高几倍,这时细菌纤维素产生稍降低。还观察到,在pH 5.0,在培养期间平均DP16,800 降到11,000,而在pH 4.0,这些改变可忽视。在pH 5.0得到纤维素物理特性差,即是,低抗拉强度(低Young弹性值)。
这些结果及纤维素酶和CS操纵子基因定位,提示在A. xylinum纤维素生物起源涉及内-1,4-β-葡聚糖酶和外-1,4-β-葡糖苷酶(Tahara, 1998)
特别是,在生长后期合成中,它可能与初始β-葡聚糖链降解有关。而且,A. xylinum BPR 2001-1,4-β-葡糖苷酶显示在水解和转糖基活性两方面(Tahara et al., 1998),与其它糖苷酶相似,在端基碳结构不引起倒置。这后者活性可对聚合物平均DP内部改变负责,然而,必须进一步研究去解释这设想。对这可能性的初步证据是黄豆细胞试管培养的表现。其β-葡糖苷酶活性,还有转糖基活性,加之细胞长度增加,因为这种酶特别参与在半纤维素前体糖苷残基转移到细胞壁的生长末端,这里发生多糖集中合成(Nari et al., 1983)
无论A. xylinum纤维素酶是否涉及在饥饿期纤维素形成释放储备能量,这一直是待解答的问题,虽然有些研究证实了这论点(Okamoto et al., 1994)。已知某些菌核内-1,3-β-葡聚糖酶也在起作用(Jones et al., 1974)
最近观察指出,细菌纤维素的物理特性和DP的改变,应用一些化合物影响其生物合成,或是用A. xylinum纤维素酶开发其活性和特异性已获得成功。
8.细菌纤维素的生物降解
无论它的起源如何,纤维素都能彻底自然降解。
然而,与植物纤维素相比,有关两者聚合物都易降解,像半纤维素和果胶,木质素,是最耐久的植物聚合物,细菌纤维素相对纯净并更易受水解纤维素酶的攻击,这酶主要由真菌和许多细菌产生。在这方面,细菌纤维素的商业应用对环境是无害的。
而且,细菌纤维素的结构和特性(大到表面区)使它能作为纤维素酶(1,4-β-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶, 之前细胞内酶, EC 3.2.1.4)和纤维素生物水解酶(纤维素1,4-β-纤维素生物水解酶,EC3.2.1.91),这是纤维素体罚主要部分,从纤维素水解菌及纤维素分解真菌系统得来特异多酶粒子。
近来,Boisset等人(1999)证明Clostridium thermocellum纤维素体比微晶Valonia ventricosa纤维素分解A. xylinum纤维素微纤维更快。应用传动电子显微镜,红外光谱和X-线衍射分析,对水解过程超微观察指出,细菌纤维素快速水解是纤维素体架构中存在的各种酶成分高效协同作用的结果。Boisset等人(2000)进一步研究表明Humicola insolvens纤维素生物水解酶Cel7A (之前CBH I)致分散细菌纤维素带薄化,而Cel6A (CBH II) Cel7A (各自比率 2:1)的化合物把带切成更小的片,于是提示部分CBH II攻击的内方式。几年来已知某些外切葡糖聚酶低固有内活性现象,并与内切葡糖聚酶比较说明纤维素生物水解酶的相同作用更有效(Teeri, 1997)。按目前观点,多样内切和外切纤维素酶系统,细菌纤维素体和真菌纤维素水解复合物两者,代表完美平衡连续活性,为各种纤维素基质提供有效降解。
 
Samejima 等人 (1997)观察到细菌纤维素对纤维素酶的敏感性,发现Trichoderma viride CBH I和内切葡聚糖酶II的混合物,彻底分解微纤维束扭曲和弯曲带样结构成线针样微晶体,并且还引起聚合物快速破碎。细菌纤维素丝带盘绕结构转变为针样,是由基片非凡盘绕动作驱动的,可能是张力释放的结果,当纤维素酶使微纤维质降解成更短的碎片。Samejima 等人 (1997)还测到,酸处理细菌纤维素,含有许多微纤维凝聚物,对两种酶攻击不敏感。
Srisodsuk 等人 (1998)也得到类似结果,用Trichoderma reesei CBH I消化微晶细菌纤维素并观察到这聚合物迅速溶解,但它的DP缓慢下降。从这微生物得到的内切纤维素酶以相反的方式攻击这基质。
两种酶水解棉花纤维素比细菌纤维素更缓慢,尽管棉花纤维素与其它植物相比表明有相当高纯度。
细菌纤维素对纤维素酶的攻击敏感的原因之一,是它有大的表面区,实际上增强全面水解和促进纤维水解酶有效结合,这是降解过程重要步骤。这结论是基于Palonen 等人 (1999)研究,发现许多T. reesei CBH I CBH II分子与细菌纤维素链接,增强了水解作用。而且,CBH II结合明显更强(从基质得到的酶吸附/脱吸附,60–70%磁滞来辅助),指出这酶明确的不同处理特性。
 
Stalbrandt 等人(1998)比较了四种Cellulomonas fimi(纤维素菌属)内切-和外切-纤维素酶抗微晶细菌纤维素和酸胀Avicel(结晶)纤维素的攻击模式。
后者对所有酶分解更有效。在多数情况观察到45–65%溶解和DP下降,Cbh B例外,引起27%溶解。已知加工酶Cbh A,达到高度细菌聚合物溶解(67%)Stalbrandt 等人 (1998)的结果证明只是细菌纤维素原纤维外表面接触C. fimi纤维素酶因为Cbh A是处理酶,它比另外三种纤维素酶清除外部原纤维更迅速并且可攻击聚合物更深内表面。因此,其它酶(两种非加工内切纤维素酶和Cbh B,显示更弱加工特性)不能有效溶解细菌纤维素。
而非结晶溶解纤维素对这些都同样有效。
 
近来研究指出高度结晶细菌聚合物完全消化不会引起任何问题,在自然环境中产生的大量各种各样内切-和外切-纤维素酶对细菌纤维素生物降解的生物应答,它们互相活性补充。而且,与之相对的植物原纤维素,需要预处理,以保证酶容易转换糖,细菌纤维素能直接被纤维素酶消化。
9.生物技术生产
为了达到细菌纤维素的高生产率和收量和降低其生产成本,要特别强调以下方面:
提供选择A. xylinum菌株筛选方法的开发,能从各种廉价废物碳源有效生产纤维素,从筛选得到的野株应用基因工程方法得到改善,A. xylinum的最佳培养条件(静止和搅拌培养、发酵罐型),细菌纤维素的形状(菌膜或是无定型凝胶)和特性(恢复力、弹性、机械强度、吸收能力)的测定,必须适合进一步聚合物应用、培养基成分的优化(碳和氮源、生物合成促进化合物、微量元素等)工艺条件(pH、温度、通气)。
这些将在后面讨论。
 
9.1.细菌纤维素产生株的天然分离和改良
选择适宜A. xylinum株的方法之一是从一些菌株来筛选,不能氧化葡萄糖由葡糖酸到2-, 5-, 2,5-酮葡糖酸(Winkelman andClark, 1984; Johnson and Neogi, 1989; De Wulf et al., 1996; Vandamme, 1998)。在这方面和BrO离子,De Wulf et al. (1996)应用一种含Br的琼脂营养培养基结合酸性pH以释放对A. xylinum细胞有毒的溴分子。只是这些突变体,不能把葡萄糖转变成葡糖酸或其衍生物,能存在于培养基之中。
Vandamme et al. (1998)成功应用这种方法去分离A. xylinum KJ33株,能产生3.3 g纤维素L. A. xylinum菌株,不能代谢培养基含有的葡萄糖成葡糖酸(Johnson and Neogi, 1989)。另外一些酸,能从CaCO3选择的方法避免葡萄糖向有机酸的转换,选择有缺失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变,在搅拌培养中完成。为相同目的,即最好纤维素产生株的筛选,已应用向生长培养基中加入纤维素酶的方法(Brown, 1989c)
 
用化学化合物突变,如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍或乙基甲烷磷酸盐,以及用紫外光照射得到突变物,显示有更高的纤维素产生力,减少可溶多糖腊脂合成和非常低级葡萄糖向有机酸的转换(Johnson and Neogi, 1989)
A.xylinum菌株的筛选还有随意分离或诱生纤维素II-产生突变的目的。这种纤维素是由细菌合成的,形成光滑菌落并且不能在营养培养基表明产生薄膜。相反,聚合物是分散在整个培养基容积之中的。
 
最好的细菌纤维素产生筛选也有传统操作,是用个别单独培养的合成物活性测定的。例如,Toyosaki et al. (1995)从大量植物(水果,花卉)样本分离2096醋酸菌株和在营养培养基表面形成膜的412株进行深入研究。
产生A. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001 –菌株的过程,是在搅拌培养中有效合成细菌纤维素的。
9.1.1.应用基因工程改良纤维素产生菌株
除了A. xylinum以外微生物的各种糖酶基因密码表达,增加可利用碳源的范围,可以增加细菌纤维素的产量和降低培养基价格。以醋酸菌属的Leuconostoc mesenteroides基因蔗糖磷酸酶表达为例(Tonouchi et al., 1998),利用蔗糖作为碳源和增加纤维素产生。此外,Nakai等人(1999)在A. xylinum株从绿豆(Vigna radiata, Wilczek)基因突变蔗糖合成酶表达的方法得到双倍纤维素产量。突变酶,这11丝氨酸残基,由谷氨酸替代(S11E);这引起工程酶对UDPGlc合成中蔗糖和有助糖裂解有更高亲和力。突变基因引入A. xylinum在重组株改变了蔗糖代谢,但针对UDPGlc合成也建立了一新路径(Figure 13)。能量操纵这过程是葡萄糖的糖苷键裂解而不需要任何其他能量投入,这是UDPGlc由常规路径合成时的情形。此外,在葡萄糖聚会过程产生的UDP分子能直接通过蔗糖合成酶活性再利用,观察到偶联反应速率增加和纤维素合成有更高比率。应该强调在高等植物UDPGlc合成具有两个系统。
13.A. xylinum重组株的UDPGlc生物合成途径包括蔗糖合成酶(SucS)基因。其它缩写与图6相同,(见7.1段)。
9.2.发酵生产
液体培养基表面生长和皮样垫胶状物形成是A. xylinum菌株的天然特性。
因此,静止状态似乎是细菌纤维素合成的最佳条件。然而,静止培养的主要缺点是,如在聚合物形成,只是能形成膜片和有相当低的生产力,应该促进新发酵工艺的发展。
9.2.1.碳和氮源
在细菌纤维素生产收量的影响因素研究中,多集中在碳源。多在单、双和多糖、乙醇、有机酸和其它成分,相比Jonas Farah (1998)发现首选碳源是D-阿糖醇和D-甘露醇,而结果与葡萄糖相比是各自产生高达6.2 3.8倍纤维素。这两种糖醇在整个培养期间提供了pH稳定性,因为它们不能转换葡萄糖酸。
Tonouchi 等人 (1996),应用一A. xylinum菌株从葡萄糖和果糖得到纤维素,发现果糖刺激磷酸葡萄糖异构酶和UDPGlc 焦磷酸化酶活性,因此增加纤维素的收量。
当在营养培养基(Masaoka, 1993)中麦芽糖是唯一碳源时,细菌纤维素的产生比含葡萄糖培养基低10倍和聚合物比有葡萄糖(DP=11,500)存在明显更短(DP=4000–5000)
Matsuoka等人 (1996)研究了使用A. xylinum ssp. 乳糖发酵 BPR2001菌株在搅拌培养中纤维素合成并发现在生长培养基中有乳酸存在能刺激细菌生长和提供纤维素收量4--5倍。乳酸的来源通常是玉米浸泡液(CSL),它是细菌纤维素生产应用培养基的主要成分,特别是在搅拌培养。与葡萄糖和果糖相比,乳酸不能转换UDPGlc,但在柠檬酸循环中经丙酮酸和草醋酸代谢,这是纤维素产生的能源。向生长培养基中提供乳酸,可进行乳酸菌和醋酸菌的混合培养。使用Lactobacillus, Leuconostoc, PediococcusStreptococcus菌株得到最好结果。乳酸菌和醋酸菌在有蔗糖水解物酵母(β-呋喃果糖苷酶产生物)存在也能生长。这方法提供细菌纤维素高收量,在搅拌培养14天之后得到,纤维素8.1/(Seto et al., 1997),乳酸菌株,只有6.4/升。
纤维素合成刺激化合物之一好像是乙醇(Naritomi et al.,1998) A. xylinum在含果糖培养基中连续培养,显示10乙醇/升,增加细菌纤维素收量,但浓度在15/升则阻止聚合物合成。这些结果提示与乳酸类似,乙醇也是一种能源(积聚ATP)并不是纤维素合成的基质。ATP激活果糖激酶和抑制葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,因此阻止6-P-葡萄糖向6-磷酸葡萄酸转化,可推断,由于这些偶联反应-果糖总量深入异构化至葡萄糖-6-磷酸增加。
 
每个产生纤维素菌株都需要一特殊复合碳源,不仅要提供氨基酸、还有维生素和无机盐。这些需求可使用酵母提取物、CSL及酪蛋白和其它蛋白水解物来满足。首选氮源是酵母提取物和蛋白胨,由Hestrin Schramm (1954; H-S medium)开发了典型培养基的基本成分,应用于大量细菌纤维素合成研究。但是,在搅拌培养多推荐的碳源是CSL(Johnson and Neogi, 1989)。还发现,在昂贵培养基成分的主要部分,即酵母提取物和细菌蛋白胨,能用CSL或包心菜汁代替。还有工厂废弃物质,如甜菜糖浆,从淀粉水解物分离葡萄糖之后的废液以及乳清和某些工业发酵废物(即用乙醇沉淀右旋糖酐之后的废液)是适宜的培养基成分(Krystynowicz et al.,2000)
在细菌纤维素合成中维生素的影响研究(Ishikawa et al., 1995, 1996b)表明有最大促进有吡哆醇、烟酸、对氨基苯甲酸和生物素,并且甚至CSL培养基也能用这些物质强化。也鉴定出某些其它成分,也能强烈刺激A. xylinum菌株产生纤维素,像胆碱asjunz衍生物、甜菜碱和脂肪酸(盐和酯类)(Hikawu et al., 1996)。应用最佳生长培养基成分能达到高细菌纤维素的产生(至25/升)是通过数学法和计算机分析设计的(Joris et al., 1990; Embuscado et al.,1994; Vandamme et al., 1998; Galas et al., 1999)
9.2.2. pH和温度影响
pHA. xylinum纤维素产生和特性的影响分析指出,最佳pH取决于菌株和通常变化在4.0 7.0 之间。(Johnson and Neogi,1989; Galas et al., 1999).例如,Ishikawa 等人. (1996a) Tahara 等人. (1997),应用两个不同的A. xylinum菌株,在pH 5.0观察到产生聚合物最高。Krystynowicz 等人. (1997)也发现在同样pH最理想。在不同pH所得聚合物的吸附特性比较,这些纤维素是在S-H培养基中pH 4.8–6.0积聚的,表现有最高水结合能力(Wlochowicz, 2001)。除了培养基的pH之外,还有温度在影响细菌纤维素的收量和特性。大量的试验报道温度范围在28-30°C,并且它的变化能引起纤维素DP和水结合能力的改变。例如,在30 °C与在2535°C细菌纤维素的合成产生比较有较低DP(约10000)和更高水结合力(164%)(Wlochowicz, 2001)
9.2.3.静止和搅拌培养;发酵罐型
细菌纤维素合成无论是运行在静止培养还是沉没状态,提供适当搅拌和充气,对于培养基的匀质和有效质量转移都是必要的。培养条件的选择完全取决于聚合物用途和目的。
在静止培养中产生的纤维素主要取决其表面/容量比率。最佳表面/容量比率可以不受非常高(不必要)或是非常低的充气(细胞生长和纤维素合成终止)的影响。报告表面:容量比率的值变化在2.2 cm -0.7 cm。在静止状态细菌纤维素合成可以通过一步(培养基中含5–10%细胞悬液)或两步程序来完成。后者是从搅拌发酵开始的,然后是静止培养(Okiyama et al., 1992)Krystynowicz et al. (1997)改良了这两步程序并且所应用的细胞,是在两步程序静止培养中得到的。薄膜含有A. xylinum E,第一步(24h),切下一致的片并用作启动下次培养的第接种物,运行4-5天。这方法能提供均匀的细菌生长并产生一致的膜片。
在静止培养中细菌纤维素合成的控制是非常困难的,因为膜片是浸进液体培养基中。一特别重要参数,需要持续控制,就是pH
pH值对生长和多糖合成有最佳影响。因为pH调节的常规方法不能用于静止培养,Vandamme等人(1998)应用一种内部pH控制,是通过最佳发酵培养基设计,放入乙酸作为Acetobacter sp. LMG1518d 的附加物。乙酸代谢产物阻止了由酮-葡萄糖酸盐形成引起的pH降低,并为生长培养基全程提供了5.5恒定的pH
更好的细菌纤维素合成控制能在特殊发酵罐中取得。在水平发酵罐中产生的纤维素,它提供了静止和浸没相结合的培养。这聚合物是在沿长轴旋转的滚筒或圆盘表面之上(Figure 14)。它的表面部分暂时浸泡在液体培养基中或是在其表面(空气中)之上。这方法的优势包括有更大聚合物表面,纤维素合成是一型中空纤维,不同直径及好的程序控制,容易规模化,对细菌附着和产生沉积有事宜表面,有更好的基质利用,更高速率产生纤维素,可以补充营养,在加工过程有更多通气,等等。(Sattler Fiedler, 1990)Bungay Serafica (1997)在一升盘(直径12 cm)发酵器中生产细菌纤维素并且表明最佳糖(蔗糖或葡萄糖)浓度是10 g L,圆盘转速12 r.p.m.和恒定pH 5.0Krystynowicz等人 (1997)成功应用11-升反应器含有细菌纤维素菌株H-S培养基3(Figure 15)。它的11个盘(每个直径12 cm)最佳转速大约3 r.p.mA. xylinum E25合成纤维素干重,在生长7天之后得到多达4.2 g L
14.在水平发酵器中滚轴表面形成A. xylinum纤维素。
15.在旋转盘发酵器中盘沉积A. xylinum纤维素。
在深层培养中细菌纤维素的产生通常需要普通发酵罐,装备有某些静力部分(挡板,刀片等),能使细胞粘附,因为纤维素在自由水相中合成通常是滴状的。同样,在各种水不溶微粒,如沙,硅藻土或是玻璃珠,加入到培养基中,会增加细菌纤维素的产生,因为细菌在颗粒上形成的生物膜大概受限于氧传输,并且葡萄糖氧化葡萄酸停止(Vandamme 等人1998)
大规模纤维素生产,用持续搅拌和通气的发酵罐会遇到许多问题,包括自然发生细胞突变,造成纤维素生产衰退。最佳搅拌和充气能防止动荡,波动会在纤维素聚合和结晶有负面影响,能降低多糖产量。例如,搅拌速率达到60 r.p.m.和充气每分钟每容量0.6容量(v.v.m.)A. aceti ssp. xylinum ATCC 2178株在一300-L发酵罐在30 °C培养45小时和得到10 g BC L d(Laboureur, 1988)Ben-Bassat等人(1989)研究在14-L Chemap发酵罐中A. xylinum 1306–21株细菌纤维素生产,在含葡萄糖和CSL2%CSL培养基中培养。搅拌速率相对于900 r.p.m.和溶解氧浓度相对于30%气体饱和。聚合物收量5.1 g L dChao 等人(2000)应用一50-L内部环流反应罐用A. xylinum sp. BPR2001株细菌纤维素合成。用浓缩氧气体充气,67小时之后,纤维素收量从3.8 增加到 8 g L
在发酵罐细菌纤维素产生遇到真菌或链霉菌培养类似搅拌问题,因为这些微生物多数生长小球或细丝形及它的培养基变为非牛顿液体。在各种形状颗粒的浓稠悬液中形成高浓度菌丝限制搅拌和气体输送。搅拌速率增加以改善充气和由于剪力引起的产品结构破坏。Bauer 等人(1992)把这情况加以考虑并在生长培养基中加入聚丙烯酰胺保护剂,用于发酵罐中细菌纤维素合成。这种保护剂减少了剪力破坏并影响特别高密度生产是否定的,因为使细胞生长率降低。
某些代谢物的积累也能影响纤维素的产生。例如,Kouda 等人 (1998) 研究表明高分压二氧化碳对A. xylinum生长有负面影响并且减少细菌纤维素收量。
Laboureur (1998)开发了一种方法应用A. xylinum sp. ATCC 21780株在300- 500-L发酵罐,培养基含5%蔗糖,0.05%酵母提取物,0.2%枸橼酸,氮盐,镁和磷酸盐,生产细菌纤维素。培养基用12%接种物接种,培养160小时。这过程是在30°C运行45小时和pH 4.8,和充气速率0.6 v.v.m。细菌纤维素合成收量达18 g L d(10 g L d). 另外菌株Acetobacter sp. ATCC 8303,28 °C pH 4.6,生长,应用改良培养基,含0.28%葡萄糖,0.07%麦芽糖,0.03% CSL,0.03%酵母提取物。充气开始是1 v.v.m.33小时和这过程的最后是0.5 v.v.m,细菌纤维素的收量是13 g L d
向大容量发酵罐准备适宜细胞密度的接种物也是个问题,主要是因为是包裹在纤维素之中。为释放细胞和增加其密度,Brown (1989c)应用纤维素酶制剂使部分纤维素溶解。有这些酶存在时,细胞密度达到10mL,而缺失酶时,只有1.1210 mL,在生长30小时之后。
除了上述方法之外,各种直径中空原纤维形的纤维素生产也在试验(Yamanaka 等人1990)。这样的材料对小直径血管的生产应该是特别有益的。这中空细菌纤维素原纤维素在一种氧可渗透空心载体的内和/或外表面细菌纤维素产生菌生长得到的,产生形状,例如,玻璃纸,特氟龙,硅树脂,陶瓷等。
9.2.4.连续培养
微生物纤维素也能做静止连续培养产生(Sakair 等人1998)A.xylinum株在一些盘上生长,在S-H培养基中,2天之后在表面获得薄膜产生,通过十二烷基磺酸钠洗浴以杀死细胞并放在通风滚筒上。这过程继续几周,滚动速率35 mm h
和每8-12小时把新鲜S-H培养基加入盘中以保持其最佳水平。应用这方法可以收集大于5 m的纤维素细丝,指出它有工业应用潜力。
9.3.外部生物合成
纤维素外部合成是纤维素研究领域最困难题目之一。第一,纤维素合成是利用纤维素酶“逆作用”, Kobayashi 等人(1991)作为催化剂,虽然化学合成方法在以前已应用。几种单体和催化剂已应用(Nakatsubo 等人1989),但都没有得到理想产品,β-1,4-链接葡糖吡喃糖的立体定向聚合物。外部细菌纤维素合成的想法是从应用A. xylinum无细胞提取物(Glaser, 1958),膜的粗制(Colvin,1980;Swissa 等人1980; Aloni 等人1982),和用洋地黄皂苷膜溶解物实验得来的(Aloni 等人1983)。这些研究证明UDPGlcA. xylinum纤维素合成基质,c-di-GMP是特异催化剂(Ross 等人,1987),及钙和镁离子对这过程是至关重要的(Swissa 等人, 1980)。外部合成是用洋地黄皂苷溶解A. xylinum细胞膜进行的(Lin 等人,1985),得到纤维素纤维直径17 ± 2 Å
9.4.化学-酶合成
在纤维素化学合成实验中尚未得到预期结果。分支和低分子量葡聚(Husemann Muller, 1966)β-1,4- and α-1,4-链接葡糖吡喃糖的聚合物(Micheel Brodde, 1974)被得到。
 
Kobayashi 等人 (1991)成功实验指出,应用联合化学和酶方法可以导致纤维素外部合成的商业发展。
作者应用β-D- cellobiosyl氟化物,通过化学合成方法得到,一种基质和T. reesei纤维素,在水-有机溶剂系统(乙酸缓冲液pH 5.0和氰化钾烷,1:5 v/v 的一种混合物)中催化并获得水不溶“合成纤维素”,用DP > 22. X-线C-NMR分析表明这产物是纤维素II
作者叙述产品的DP取决于反应条件,特别是水-有机溶剂成分。他们发现更高浓度基质和乙腈存在,这纤维素酶,作用如糖基转移酶-主要产生可溶纤维低聚多糖(DP 8),还可发现许多用途。虽然这些研究没能继续,由Kobayashi提出的方法对外部纤维素产生对所有酶有望做出选择。
 
9.5.预期未来应用的产品加工
最近,一大规模细菌纤维素生产独创方法是由Nichols Singletary (1998)提出的,应用转基因植物结构专利想法去生产这种聚合物的可能性。作者想表达三种A. xylinum CS基因(bcsA, bcsB, bcsC, 7.4)和在作物(马铃薯,玉米,燕麦,高粱,小米,小麦,稻,甘蔗等)的存储组织(根,块茎,谷粒)中两个A. xylinum二甲脒基环化酶基因。他们设想得到大量纯聚合物,容易和廉价收获。按照他们的方法,生产要比发酵法更便宜。作者还强调他们的程序在生态学方面,因为纯纤维素生产转基因植物的培育的附加利益,将比使用森林资源更经济。
9.6.复原和纯化
经过静止或搅拌培养得到的微生物纤维素不是很纯并含有某些杂质,像培养基成分和A. xylinum完整细胞。在用于医药,食品加工,或甚至造纸业之前,必须去除所有这些杂质。
最广泛应用纯化方法之一是基于用NaOH,稀释酸,氢氧化物(以钠和钾为主),氯化钠或次氯酸溶液,有机溶剂或热水处理细菌纤维素。这些试剂可以单独或联合使用。(Yamanaka等人1990)。细菌纤维素浸泡在这样溶液中(14-18小时,某些情况达24小时),升高温度(55–65 °C)能明显减少细胞数和着色程度。
还有报道预先用自来水冲洗之后在2% NaOH溶液中煮沸(Yamanaka 等人1989) Watanabe等人(1998a)这聚合物在0.1 NaOH 80 °C浸泡20分钟然后用蒸馏水洗涤。Takai等人(1997)用蒸馏水和2% NaOH处理细菌纤维素,用2%乙酸中和这膜。
Krystynowicz 等人. (1997)开发了一种程序开始用自来水清洗初始细菌纤维素(过夜),随后在1% NaOH溶液中煮沸2小时,在自来水中洗涤以彻底去除NaOH1天),用5%醋酸中和,再用自来水去除它。获得的最终细菌纤维素制剂含有不足3%的蛋白,适于某些食品和医药目的。
细菌纤维素医学应用需要特殊处理以去除细菌细胞和毒素,因为它们能引起热源反应。最有效的方法之一是开始用可吸收的片材从两面轻轻压挤纤维素膜以排除80%的液相,然后把膜垫浸泡在3% NaOH12小时。这过程要重复3次,之后把膜片浸泡在3% HCl溶液中,挤压并在蒸馏水中彻底清洗。
纯净膜经高压消毒或是钴60照射。它可作为良好的创伤绷带,因为它仅含1–50 ng脂多糖内毒素,而应用常规方法纯化细菌纤维素通常会含有30 µg或是更多的这些物质。(Ringet al., 1986).
10.特性
细菌纤维素是一种非常难溶解、有弹性和易伸缩的聚合物,有很强拉力。它是网状结构,是由高度结晶和高度单向纤维素亚原纤维组成大量的带状原纤维。这是三维结构,在植物原纤维素是看不到的,这导致了细菌纤维素高结晶指数(60–70%)。而且,植物聚合物纤维比细菌纤维素的微纤维要粗100倍,因此细菌聚合物有大200倍的可及面。以搅拌培养A. xylinum纤维素做比较,在静止状态下聚合物合成,有更高DP(各为14,400 10,900)、结晶指数(各为71 63%)、拉力强度(Young's系数各为33.3 28.3)、但有低水容性(每克细菌纤维素各为34170)和在它分解形态悬浮粘度(各为0.04 0.52 Pas,(Watanabe et al., 1998a)
微生物纤维素表现是凝胶状的,因为它的液体成分(通常是水)存在于非常细小的带的空洞中,重量至少在95%。细菌多糖有高容水性,但大部分水不与聚合物结合,用轻微压力就可以挤出。干燥的细菌纤维素可形成纸片形状,厚0.01–0.5 mm(Yamanaka et al., 1990; Krystynowicz et al., 1995, 1997)并有良好吸收特性。除了有高Young's系数外,细菌纤维素还显示有高音速并且因为这些独特机械特性,它能应用于声膜(Vandamme et al., 1998).
细菌纤维素的特性在它合成期间和培养期间完全被改变。某些成分,像纤维素衍生物、磺酸、烷基磷酸盐、或其它多糖(淀粉、右旋糖酐)、可以进入营养液中改变其肉眼形态、伸展力、光密度和最终产物的吸收特性(Yamanaka et al., 2000)。细菌纤维素还能与其它物质结合,加入湿或干的纤维素,以得到理想的理化特性成分Yamanaka, 1990)。为了这个目的应用的添加物是由各种各样的无机和有机成分组成,像铝、玻璃、琼脂、海藻酸盐、carragenan、支链淀粉、葡聚糖、聚丙烯酰胺、肝素、polyhydroxylalcohols、明胶、胶原等。它们通过注入、迭片或是吸收、或是与分解聚合物混合,与细菌纤维素片组合。这复合材料能进一步使之成形处理,于是可得到各种产品。
近来,Kim 等人(1999)报告应用L. mesenteroides (葡聚糖产生菌)dextransucrase(葡聚糖生成酶) alternansucrase(交替蔗糖酶)改变细菌纤维素的酶促方法。在有A. xylinum ATCC 10821存在时合成“可溶纤维素”,由1,4-, 1,6-, and 1,3-链接单体组成葡聚糖。
 
细菌纤维素基本特性见表2.
2.细菌纤维素特性
高纯度
高结晶度
比传统木纸浆有更大面积
薄片密度300 900 kg m
高拉伸强度,即使是在低薄片密度(500 kg m以下
高吸收力
高结合水能力
高弹性、顺应性和耐久性
无毒性
代谢惰性
生物相容性
易生物降解
维持良好形状
容易剪裁的理化特性
 
11.应用
细菌纤维素公认是安全(GRAS)多糖并因此它早已有各种各样应用。它的商业应用就是这聚合物的独特性质决定的并且根据在廉价废料改良细菌菌株的生长使生产的有效技术的发展。细菌纤维素的优点是它的化学纯度和没有在植物多糖中通常存在的物质,那需要费力提纯。除了细菌纤维素膜片形状之外,它的面积和厚度,可以通过培养条件来定制。
在它生物合成期间相对容易使细菌纤维素改变,对一些特性如分子聚集、弹性、顺应性、容水能力、结晶度指数等进行规定。细菌纤维素微纤维可于低分子量物质和聚合物结合,这例子是加入生长培养基中,于是得到新奇商品。细菌纤维素也是未来化学变型的原料。
 
估计,在一公顷(一万平方米)表面区域每年从静止培养可得到多达10,000 kg(公斤)(10吨)细菌聚合物而在同样时间、同样区域、棉花只能收获600 kg(公斤)(16.6倍),细菌纤维素的广泛应用前景变得越来越明显。
细菌纤维素的主要潜在应用概述在表3.
 
3.细菌纤维素应用
部门应用:
化妆品:乳剂稳定剂如面霜、滋补剂、护甲素和亮光剂、人造指甲成分。
纺织工业、人造皮肤和织品、高吸附材料。
旅游和运动:运动衣、帐篷和野营器材。
矿业和炼油厂废物、溢出油收集海绵毒素处理吸收和矿物质和油回收材料。
污水净化:城市污水净化和水超滤。
麦克风和立体声耳机播放灵敏膜片。
林业:人造木村替代品、多层胶合板和耐用容器。
造纸工业:专业纸、档案文件修复、极耐用钞票、尿布和餐巾纸。
机械工业:车体、飞机部件和火箭壳裂缝密封。
食品生产:食用纤维素和椰果(‘nata de coco’)。
医药:褥疮、烧伤和溃疡治疗的暂时人造皮肤,牙齿成分和动脉植入物。
实验室/研究蛋白固定、色谱技术和体外组织培养介质成分。
 
11.1.科技应用
与植物纤维素片材相比,细菌纤维素即使是在低密度板也有满意拉力。(300–500 kg m) (Johnson and Neogi, 1989)。因此,细菌纤维素是造纸的极好成分,能提供更好机械特性。细菌聚合物的微纤维形成大量氢结合物,当纸被干燥,就得到改善化学粘附和拉力强度。含细菌纤维素的纸不仅表明对固体添加物有更好抵抗,如填料和染料,而且还有更大弹性、可透气、抗撕裂和充暴力、能结合更多水(Iguchi et al., 2000)
 
有益作用如改善抗老化抵抗力,通过在棉花纤维加入小量细菌纤维素来达到,能得到手工制作纸,用于古老文档修复。这纸张显示适宜墨水承受力和特定撕扯(Krystynowicz et al., 1997)。这纸含有1%细菌纤维素就能满足对信息和文件纸
国际标准ISO 9706:1994,特定撕扯可与抹布纸相比。可能用细菌纤维素加压制模,及用作电绝缘材料的板纸生产和封皮。
 
细菌纤维素还能用于特殊纸张的表面包覆。为此,细菌纤维素过滤悬液(匀质并与其它成分混合)被加入,应用一特殊涂抹器,或是里面是湿板结构,或是部分或全部是干燥板。包被改善性质如光泽、亮度、平滑、多孔性、墨水承受性、和张力。其它添加剂像淀粉、有机聚合物、包括羧甲基纤维素、有机、或是无机色素也可应用。Johnson and Neogi (1989)声称用3%细菌纤维素(固体物质)包被的纸显示有光泽性能和表明强度与有20%传统涂层的影印纸类似。该作者还叙述用细菌纤维素和羧甲基纤维素做包被甚至有更好特性,因为它们有协同作用。
 
细菌纤维素也是合成纸的重要成分(Iguchi et al., 2000),自无极性聚丙烯和聚乙烯纤维,提供绝缘、耐热和阻燃特性,不能形成氢键。这型纸的木浆量通常是20-50%达到优良质量。应用细菌纤维素能使添加剂的量减少而对合成纸特性没有任何影响。
细菌纤维素在无纺布样产品也表明是良好粘合剂(Yamanaka et al., 1990)通常用于外科洞巾和大褂并含有各种亲水和疏水性、天然和人造纤维,像纤维素酯、聚烯烃、尼龙、有机玻璃、或是金属纤维。甚至小量细菌纤维素就能改善织物拉力和撕扯强度,例如,10%细菌聚合物相当于20-30%乳剂粘合剂。
 
细菌纤维素应用范围可以更广泛,因为它在合成期间是可变化的(Brown, 1989a,
1989b)。为此,羧甲基纤维素或是糖类共聚物和草酸可以直接加入到培养基中(Yamanaka et al., 1989)。有羧甲基纤维素存在得到的纤维素并有有机溶剂干燥有弹性和伸缩力特征及更高容水力(更快吸收更多的水)。最佳羧甲基纤维素浓度范围从0.1 to 5% (w/v)。有机溶剂的极性也能影响细菌纤维素的特性。用丙酮处理聚合物之后有弹性和橡胶样,而用无水乙醇干燥之后细菌纤维素像皮革。
因为细菌纤维素对酶消化敏感,被改变会得到各种满意生物降解力和强度的复合材料。这些产品的产生是根据纤维素和共聚物或是在含共聚物培养基中培养能产生细菌纤维素菌株之间的化学反应来决定的。
 
11.2.医学应用
从静止培养得到的纤维素膜片是容易应用的,是天然“编织”创伤敷料,适合现代创伤敷料标准(Figure 16)。它是可灭菌、生物相容性、多孔、有弹性、容易操作和贮存、吸附分泌物、提供最佳湿度,这些都是创伤快速康复、防止次生感染和机械损伤、不会粘附新生组织、烧伤热吸附可缓解疼痛的重要因素。细菌纤维素片对固定加速康复过程的药剂也是极好的载体。
16。纤维素膜片是创伤敷料的材料
 
因为细菌纤维素能有各种大小,它相对容易生产对于广泛创伤的敷料。因为近来动物源产品、胶原敷料的问题,可由细菌纤维素之一取代。这论点受到临床试验真实肯定结果额外支持。例如,细菌纤维素制剂Prima Cel,由Xylos公司生产,按美国伦斯勒理工学院在治疗溃疡临床试验用作创伤敷料。得到的结果是满意的,8周之后有54%病人恢复和其余溃疡也都痊愈(Jonas and Farah, 1998)
生物敷料
 
A. xylinum纤维素的其它商业产品,像Biofil表明作为皮肤移植物和三度烧伤治疗、溃疡、发现在恢复牙周和褥疮应用是极好的。另一制剂,Gengiflex 薄织物(Jonas and Farah, 1998)Krystynowicz 等人(2000)A. xylinum纤维素制备薄膜调查指出( 17)作为创伤敷料一般应用是可能的。
17。应用细菌纤维素敷料治疗烧伤,康复之前(a)和之后(b) (Krystynowicz
et al., 2000).
      
细菌纤维素中空管纤维用作人造血管和输尿管研究结果是有希望的(Yamanaka et al., 1990)。细菌纤维素的抗凝血特性(血液相容性)通过根据在成年狗血管(部分降主动脉和颈静脉)用细菌纤维素制造人造对应物更换的试验做出了评价。一个月之后人造脉管被取出并检查它的内表面血栓粘附状态。细菌纤维素血管保持很好的开通状态。
另一成功试验表明应用生物合成纤维素更换狗硬脑膜材料(Jonas and Farah, 1998)
 
因为它的高拉力强度、弹性、对液体和气体的可渗透性、干燥细菌纤维素用作生物传感器中附加膜保护固定的葡萄糖氧化酶,用以测定血液葡萄糖水平。这细菌纤维素膜在10倍稀释人血溶液可增强电极稳定性至200小时。其它商品保护膜,像cuprophan(AKZO, England),只提供电极稳定性30小时。在未稀释人血用cuprophan覆被的生物传感器稳定3-4小时。而细菌纤维素膜稳定性延长至24小时。
 
11.3.食品应用
化学纯和可代谢惰性细菌纤维素已在食品加工中用作非卡如里膨胀和稳定剂。和植物多糖及其衍生物的纯制剂相似,它是用作泡沫、胶质和淀粉凝胶、乳胶的稳定作用,即罐装巧克力饮料和高汤、质感改变,即,果浆稠度改善、粘度增强、脂类取代,包括油类,和饮食纤维补充剂(Ang and Miller, 1991; Kent et al., 1991; Krystynowicz et al., 1999)
 
 
细菌纤维素在食品生产首次成功商业应用是“nata de coco(椰果) (Sutherland, 1998)。是菲律宾传统甜食,是从椰乳或含蔗糖的椰水制备的,适合产生细菌纤维素细菌的生长培养基。食用菌膜能保护抵抗结肠癌、动脉粥样硬化、冠状动脉栓塞和防止尿中葡萄糖突然升高。因此椰果在亚洲以外也是越来越受到欢迎。
另一种受到欢迎的含细菌纤维素食品是中国康普茶(茶格瓦斯或茶菇),在茶和糖液中生长的酵母和醋酸菌得到。在表面形成的膜片含有对人体有益健康的纤维素和酶。它们的非生物活性对大肠和整个消化道有特殊刺激。康普茶对某些癌症有保护(Iguchi et al., 2000)
 
由一些作者提出的研究结果,应用由A. xylinum合成的细菌纤维素膜片对葡萄酒和果汁滤过液,及多酚固定是有希望的(Krystynowicz et al., 1999)。生物活性花青素制剂,在饮食纤维中被浓缩,对功能食品是很好的。细菌纤维素还表明在面包产品中是有吸引力成分,因为它起着饮食纤维的作用,保留味道和气味并延长贮存期。
 
11.4.其它应用
它有大的可触及的表面区、高度坚固、和超级吸附特性及通过物理或化学方法改变的可能性、这意味着细菌纤维素能用于生物催化剂固定载体。含有固定动物细胞的纤维素凝胶用于培养产生干扰素、白细胞介素-1、细胞抑制剂和单克隆抗体(Iguchi et al., 2000)。细菌纤维素还用于Gluconobacter oxydans(氧化葡萄糖杆菌), AcetobacterMethanolyticus(醋酸菌)Saccharomyces cerevisiae(啤酒酵母)细胞的吸附。固定菌株表明各自是葡糖酸盐(收量84–92%)、二羟基丙酮(收量90–98%)和乙醇(收量88–92%)的有效产生菌,和表现很好操作和热稳定性。
 
纯化细菌纤维素可以是醋酸纤维素、硝化纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、甲基纤维素和羟基纤维素的合成原料(Yamanaka, 1990)。即使细菌纤维素是在有混合物存在产生的,受规律原纤维组装干扰和影响β-1,4-葡聚糖结构,例如羧甲基纤维素或其它纤维素衍生物,和其它碳水化合物(淀粉、葡聚糖)、硫酸盐和烃基磷酸盐、产生微生物聚合物是新奇的、添加剂-依赖和有益特性,包括光学透明或更高水结合能力,甚至重复浸湿和干燥之后。细菌纤维素在化学、造纸和纺织工业的潜在应用是根据它价格和易取性。为适合这些需求,细菌纤维素必定是由高效菌株产生、是生长在廉价培养基中、在复杂表面、固态或深层发酵(Vandamme et al., 1998)
 
12.专利
对细菌纤维素的兴趣快速增长,反应在专利数量上(自1980年以来,每年大约有20件)和这种独特聚合物的专门出版物(近10年每年20-40本)(Iguchi et al., 2000)。某些关于细菌纤维素生物合成、特性和应用专利见表4.这些专利在章节中引用和在参考中列出。
13.前景与展望
115年前(Brown, 1886)报道第一篇科学论文是在许多国家“醋厂”(Yamanaka et al., 1989)许多年就知道由醋酸菌形成一种特殊物质。进一步研究发现这种物质就是超纯纤维素。多糖生物合成物的代谢路径和复杂分子结构,以及它的迷人动力学初期链条联想到一种具有独特性质结构已有阐述。即使细菌纤维素进展和有限商业化必定发生,但相关生物技术、与现代工业对植物纤维素技术的竞争,尚未开发。
那么,怎样做才能使细菌纤维素生产达到成功并实现商业化?首先, 必须创建稳定超额生产聚合物菌株,应用分子遗传学和生物学新近成就。这些菌株必须能吸收广泛碳源并显示朝着自然突变向细胞突变是低倾向并在搅拌培养条件下能有效合成纤维素(10–15 g Ld)。新的静止和深层培养生物反应器的建造是必然的。
细菌纤维素生产成本要明显降低,用富含适宜碳源的工业废料取代昂贵营养培养基来获得、像结晶葡萄糖生产的废液等。同时,应该得到重要环境效益。然而,细菌纤维素大量生产的重要优势应该是对森林的保护,目前是在以惊人的速度在消失,因此导致土壤富营养化(污染灾害)和全球气候改变。
细菌纤维素早已具有多种用途,在回顾中提出。这种多糖不仅能取代某些动物聚合物(胶原)而且还可以携带对人体健康具有有益影响的物质(即抗氧化剂和益生元)。细菌聚合物在医学的用途(创伤、烧伤和溃疡敷料、移植物成分)已不成问题。而且,纤维素颗粒物能是药剂固定的极佳基质。例如,如果特殊物质(受体)被细菌纤维素吸附,所产生的分子能清除栖息在消化道里的毒素或病原微生物。近来,细菌纤维素独特纳米晶体(30×600–800 nm)商标(Xylos)
选择性地得到,是从它的商品制剂Prima Cel,这些纳米晶体表面的修正物(三甲基硅烷)的衍生物,获得了它剩下的完整核心。这样修正过的晶体在几种先进科技有很大潜能。
破解纤维素生物合成的所有迷津将会导致细菌纤维素超分子结构和特性的剪裁和改善,作为结果,有关它的廉价生产和对它的体积和特殊应用的新奇理念将得以发展。
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问君魂系何处?纪念馆网上安家。 2012-02-02T06:37:14 CST tag:liuyr.blog.bokee.com,2005://10061241 问君魂系何处?纪念馆网上安家。
老伴去世,我亲临火葬场目睹遗体告别、尸体火化、骨灰收集、烧花圈、骨灰安放……整整折腾了一上午,大冬天,几十名亲朋好友跟着我们忍饥挨饿,受冻受累,一次次地排队等候,火葬场里的哭声、乐队演奏哀声、人群交错、黑烟滚滚、气味熏人……真是劳民伤财啊!
老伴的亲姐姐,年近八十,率领儿子、女婿、女儿、外孙女七人,从数千里之外的长春乘坐飞机赶往兰州为妹妹送行。就像佘太君“百岁挂帅”那样令人感动,可是,感动之余,人们心里还是没有着落啊,故去的和活着的,还是空荡荡啊,一了百了,心灵没有解脱,哀思没有寄托,空留遗憾在心头啊!
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现在,亲人已经返回东北,但是,大家仍然可以去亲人的纪念馆会面,吊唁。
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