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我,老白龙马,1940年生于祖国东北;56年学医于西北,61年入伍行医于西部核基地,身患核辐射病后68年退役;本人从事半个世纪医学生物,工作单位:兰州生物制品研究所,退休后和患老年痴呆症老伴相依为命,老伴去世后以电脑为伴 更详细
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三八节祭文(细菌纤维素)

字体大小: - - liuyr   发表于 2012-03-06 16:41     阅读(10146)   评论(0)     分类:
老白龙马留言:
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细菌纤维素
作者: Stanislaw Bielecki
2005 1
 
目录
摘要
1. 前言
2 .历史概述
3. 细菌纤维素结构
4. 化学分析和测定
5. 产生菌
6. 生理功能
7. 细菌纤维素的生物合成
8. 细菌纤维素的生物降解
9. 生物技术生产
10. 特性
11. 应用
12. 专利
13. 展望和远景
参考
缩写
主题
 
1. 前言
2. 历史概述
3 .细菌纤维素的结构
4. 化学分析和测定
5 产生菌
6 .生理功能
7 .细菌纤维素生物合成
7.1 .纤维素前体合成
7.2 .纤维素合成酶
7.3 .生物合成机制
7.4 .纤维素生物合成的基因基础
7.5 .细菌纤维素合成控制
7.6 .由 A. xylinum 的可溶多糖合成
7.7 .由 A. xylinum 合成的细胞内和细胞外纤维素的作用
8 .细菌纤维素的生物降解
9 .生物技术生产
9.1 .天然源分离和细菌纤维素产生菌株改进
9.2 .发酵生产
9.3 .体外生物合成
9.4 .化学—酶合成
9.5 .预期在未来应用的生产工艺
9.6 .回收和提纯
10 .特性
11 .应用
11.1 .科技应用
11.2 .医学应用
11.3 .食品应用
11.4 .其它应用
12 .专利
13 .展望和前景
 
 
1. 前言
纤维素是地球上最丰富的生物聚合物,公认是植物界的主要成分,但也代表微生物细胞外聚合物。细菌纤维素( BC )属于基础代谢的特殊产物并且是一种保护包被,而植物纤维素( PC )起着结构作用。
由细菌合成的纤维素是属于醋酸菌属( Acetobacter )、根瘤菌属( Rhizobium )、土壤杆菌属( Agrobacterium )和八叠球菌属( Sarcina (Jonas and Farah, 1998 ) 。最有效的生产菌是革兰氏阴性、醋酸菌 Acetobacter xylinum (重新分类为 Gluconacetobacter   xylinus , Yamada et al., 1997 ; Yamada, 2000 ),用于微生物基础和纤维素研究 (Cannon and Anderson, 1991 )
研究集中在生物聚合物合成机制及决定它实际应用的机构和特性 (Legge, 1990 ; Ross et al., 1991 ) 。细菌纤维素最重要特性之一是它的化学纯度,是它与通常伴有去除特别困难半纤维素和木质素的植物纤维素的区别。
因为这独特性质,是从超细网状结构产生的,因此,细菌纤维素发现在造纸、纺织品和食品工业以及在化妆品和医药中的生物材料的诸多应用 (Ring et al., 1986 ) 。这种多糖的广泛应用显然是根据生产规模及其价值决定的。因此,基础研究和菌株改良和生产工艺开发加强研究同时进行。
 
2 .历史概述
1886 年由 A. J. Brown 首次报道 A. xylinum 细胞外胶膜合成,细菌纤维素在 20 世纪后半期引起更大关注。 Hestrin 等人 ( 1947 , 1954 ) 开始应用 A. xylinum 作为模型菌集中研究细菌纤维素合成,证明休眠和冻干醋酸菌细胞在有葡萄糖和氧存在可以合成纤维素。随后 Colvin ( 1957 ) 在含无 A. xylinum 细胞提取物、葡萄糖和 ATP 的样品测到纤维素合成。在细菌纤维素合成研究的里程碑,在这评论中提出,不仅是细菌聚合物的生物起源,而且还有对植物所做的贡献,导致了在自然界最重要进程之一的了解。
真实的历史概述提出贯穿下面所有章节,包括参考。
 
3 .细菌纤维素结构
在细菌纤维素广泛研究,细菌纤维素的化学性与植物纤维素一致,揭示纤维素是β— 1,4 无支链聚合物连接吡喃葡萄糖残余,但它的大分子结构和特性与后者不同(图 1 )细菌纤维素初生链聚集形成亚原纤维,宽约 1.5 nm 和薄的自然发生的纤维,只相当于某些植物形成层中和奎宁粘液中检测到的纤维素次级纤维。细菌纤维素亚纤维被结晶进入微纤维 (Jonas Farah, 1998 ) 。这些成束和之后成带 (Yamanaka et al., 2000 ) 。按 Zaar ( 1977 ) 带的大小是 3–4 ( )×70–80 nm ( ), Brown et al. ( 1976 ) 3.2×133 nm, 或按 Yamanaka 等人 . ( 2000 ), 4.1×117 nm ,而桦树或松树桨产生纤维素纤维宽度是两个数量级 2–2 和各为 3.0–7.5×10 mm ,微生物超细丝带更大 1.4–4.0×10 纤维素,它的长的范围 1 to 9 µm, 形成一
稠密网状结构 (Figure 2 ) ,结合大量的氢来稳定 (Figure 3 ) 。细菌纤维素与它的培养对应物也有区别,在高结晶指数( 60% 以上)和不同的聚合程度,通常在 2000 6000 之间, (Jonas and Farah, 1998 ) ,但在某些情况甚至可达到 16,000 20,000 之间 (Watanabe et al., 1998b ) ,而培养聚合物的平均聚合程度变化从 13,000 t 14,000 (Teeri, 1997 )
 
1. 植物纤维素“边饰微粒”纤维与细菌纤维素微纤维比较模式图 (Iguchi et al., 2000 ; with kind permission)
2. 静止培养 A. xylinum 得到的细菌纤维素膜扫描电子显微镜图像( a )和附着在纤维素带的细菌细胞( b
3. 在纤维素中链外( a )和链内( b )氢键。
A. xylinum
细菌纤维素肉眼形态完全根据培养条件而定 (Watanabe et al., 1998a ;Yamanaka et al., 2000 ) 。在静止条件下(图 4 )细菌积聚纤维素膜 (S-BC) 出现在营养培养基表面,是在氧气丰富的气液界面。纤维素亚纤维,在细菌细胞表面从直线序孔连续伸出、结晶成微纤维并强行深入生长培养基中。因此,皮革样薄膜供养 A. xylinum 细胞群,由重叠和绞合纤维素带组成,形成平行有秩平面 (Jonas and Farah, 1998 )
静止培养细菌纤维素临近索支和互相连接比搅拌培养产生的细菌纤维素更少、在一型不规律颗粒、星形和纤维索、在培养基中很好分散(图 5 (Vandamme et al., 1998 ) 。在搅拌细菌纤维素网状索相互连接形成网格模式,并有粗略垂直和粗略平行定位 (Vandamme et al., 1998 )
4. 在静止培养中形成的细菌纤维素膜。
5. 在搅拌培养中形成的细菌纤维素小球。
搅拌纤维素和静止纤维素在三维结构之差异在扫描电子显微镜显而易见。静止纤维素纤维有更大扩展和一个交叉堆积在另一个上面。搅拌纤维素索被缠绕和弯曲 (Johnson and Neogi, 1989 )
此外,它们有更大横截面比静止纤维素纤维宽 (0.1–0.2 µm) (通常是 0.05–0.10 µm )。静止纤维素和搅拌纤维素之间的形态差异致使结晶度数不同、不同晶粒大小和纤维素 I 容量。
纤维素有两种常见结晶型,定为 I II ,由 X 光、核磁共振 (NMR) 、拉曼光谱和红外线分析来区别 (Johnson Neogi, 1989 ) 。已知在相对稳定纤维素 I ,多是由植物也可以由静止培养的 A. xylinum 合成,平行 β -1,4- 葡聚糖链是单向排列,而纤维素 II β -1,4- 葡聚糖链排列随意方式。它们多是反平行的并有大量氢键链接,这结果是使纤维素 II 有更高热稳定性。
搅拌细菌纤维素比静止细菌纤维素有更低结晶度指数和结晶更小 (Watanabe et al., 1998a ) 。还注意到,在搅拌培养中合成的细菌纤维素发生大部分是纤维素 II 。在自然界,纤维素 II 只有几种生物合成(某些海藻、霉菌和细菌,像胃八叠球菌( Sarcina ventriculi )) (Jonas and Farah, 1998 ); 这种纤维素的工业生产是根据植物纤维素化学转换。
C-NMR (核磁共振)有可能揭示纤维素 I 的存在和 I 的两个独特的纤维素型 (Watanabe et al., 1998a ) 。这些型发生在海藻、细菌和植物衍生的纤维素中。后者比细菌纤维素含有更少纤维素 I(Johnson and Neogi, 1989 )
纤维素 I 不可逆晶体转变到 I 改变 X 线和 CP/MAS C-NMR (核磁共振)光谱是因为在单元细胞中的差异。静止细菌纤维素比搅拌细菌纤维素含有更多纤维素 I 。已报道在搅拌细菌纤维素和静止细菌纤维素之间纤维素 I 的差异超过结晶度指数 (Watanabe et al., 1998a ), 和大部分纤维素 I 是与晶体大小密切相关。
 
4 .化学分析和测定
为了测定纤维素的结晶或非晶态,有几种直接染色用于线状 β -1,4- 葡聚糖是特异性的 (Mondal and Kai, 2000 ) 。都是荧光增白剂并形成色素 - 纤维素复合物,由范德华和 / 或氢键合来稳定。
这些染料之一是荧光增白剂 卡尔科弗卢尔( Calcofluor )。这种直接染料不仅能使纤维素链可视,而且还能广泛用于初生纤维素链联合和结晶化研究 ( 见章节 7.3.2 )
纤维素平均重量 DP DP 分布是用硝化纤维素样品通过高性能凝胶渗透来测定的 (Watanabe et al., 1998a )
在搅拌培养条件下产生的微生物纤维素的网状结构和在静止培养形成的纤维素膜有条理分层结构之间的区别,在扫描电子显微镜图像显而易见 (Johnson and Neogi, 1989 )
为了区分来自纤维素 II 反平行之一的纤维素 I 平行链结晶格,可应用 X 线衍射、拉曼光谱、红外线分析和核磁共振 (Johnson and Neogi, 1989 ) 。结晶度指数和结晶大小是根据 X 线衍射测量值来计算的 (Watanabe et al., 1998a ) 。纤维素 I 有两个独特型,即纤维素 I I X 线衍射不能区分、因此 CP/MAS 核磁共振分析,在冻干纤维素样品进行,对这大量组分进行判断 (Watanabe et al., 1998a )
纤维素的理化特性像容水能力、分解纤维素悬液的粘度和干膜 Young's 系数是应用常规方法测定的 (Watanabe et al., 1998a , Iguchi et al., 2000 )
 
5 .产生菌
细菌纤维素是由几个菌属合成的,其中醋酸菌株( Acetobacter )最著名。纤维素生产菌概述见表 1. (Jonas and Farah, 1998 ) 。聚合物的结构是根据微生物而定的,虽然它的生物合成路径和它的调节机制在大部分细菌纤维素产生细菌可能是共同的 (Ross et al., 1991 ;Jonas and Farah, 1998 )
Table 1. BC producers (Jonas and Farah, 1998 , modified)
GenusCellulose structure
Acetobacte r extracellular pellicle composed of ribbons
Achromobacter fibrils
1. 细菌纤维素产生菌 (Jonas and Farah, 1998 , modified)
菌属                 纤维素结构
醋酸菌属( Acetobacte           胞外丝带组成薄膜
无色菌属( Achromobacter        原纤维
气杆菌属( Aerobacter           原纤维
土壤杆菌属( Agrobacterium      短小纤维
产碱杆菌属( Alcaligenes         原纤维
假单胞菌属( Pseudomonas       不明显小纤维
根瘤菌属( Rhizobium            短小纤维
八叠球菌属( Sarcina             无定型纤维素
动胶菌属( Zoogloea             尚未确定
A. xylinum (同义词 A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus ),是纤维素最有效产生菌,近来重新分类并包括在新奇菌属葡糖酸醋酸菌属( Gluconacetobacter )中 , 木葡萄酸醋杆菌( G. xylinus (Yamada et al., 1998 , 2000 ) 和某些其它菌属( (G. hansenii, ropaeus, G. oboediens, and G. intermedius). )一起。
 
6 .生理功能
在自然栖息地,大部分细菌合成胞外多糖,在细胞周围形成包封 (Costeron, 1999 ) 。细菌纤维素就是这样物质的一个例子。纤维素产生菌的细胞包封在聚合物网络之中,常常在液 - 气界面维持群聚 (Wiliams and Cannon, 1989 ) 。因此,细菌纤维素形成菌株能栖息在污水中 (Jonas and Farah, 1998 ) 。聚合物基质使部分细胞粘附于任何可接近的表面并促使营养提供,因为它们在聚合物格架中浓集,与周围水环境相比,由于它的吸附特性而明显增强 (Jonas and Farah, 1998 ; Costeron, 1999 ) 。某些作者设想,由 A. xylinum 合成的纤维素也可以起储存作用并能被饥饿微生物利用。它的分解是由外和内葡聚糖酶催化的,这种联合存在,在某些产生纤维素 A. xylinum 菌株的培养基中被检测到 (Okamoto et al., 1994 )
因为纤维素层的粘度和亲水特性,使产生的细菌在栖息地对不利变化(水容量减少、 pH 变化、毒性物质、病原微生物的存在、等 )抵抗增强,并且它们在包膜内能进一步生长和发育。还发现细菌周围的纤维素使它们对紫外光的照射得以保护。在紫外光照射 1 小时处理,还有多达 23% 的醋酸菌细胞因为受细菌纤维素包裹而活存。如果去除保护多糖将使它们的活性急剧降低(只有 3% (Ross
et al., 1991 )
 
7. 细菌纤维素的生物合成
细菌纤维素的合成是精确和特异控制的多 - 步骤过程,涉及大量独特的酶和催化及调控蛋白复合物,其超分子结构迄今尚未明确界定。这些过程包括尿苷二磷酸葡萄糖 (UDPGlc) 合成,这是纤维素的前体,随后是葡萄糖聚合成 β -1,4- 葡聚糖链,和这初生链联合特征的带样结构,由数百或数千个别纤维素链构成。
UDPGlc 合成的路径和机制已明确了解,而葡萄糖聚合成大的和无支链、它从细胞内挤出及自行组装成原纤维的分子机制,需要进一步阐述。
而且,细菌纤维素合成研究会有助于更好了解植物纤维素的生物起源。
7.1 .纤维素前体的合成
A. xylinum 的纤维素合成是碳代谢的最终产物,取决于细胞介入戊糖磷酸盐循环或克雷布斯循环的生理状态、与糖异生耦合 ( 6) (Ross et al., 1991 ; Tonouchi et al., 1996 ) 糖酵解在醋酸菌不起作用,因为它们磷酸果糖激酶路径不能合成这重要酶 (EC 2.7.1.56) (Ross et al., 1991 ) 。在 A. xylinum 纤维素合成是与氧化分解过程密切相关并消耗异化反应衍生的多达 10% 能量 (Weinhouse, 1977 ) 。细菌纤维素产生不受其它同化过程包括蛋白合成的干扰 (Ross et al., 1991 )
6. A. xylinum 碳代谢路径。 CS, 纤维素合成( EC 2.4.2 .12 ), FBP, 果糖 -1,6- 二磷酸磷酸酶 (EC 3.1.3.11) GK, 葡糖激酶 (EC 2.7.1.2); G6PDH, 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶 (EC 1.1.1.49); 1PFK, 果糖 -1- 磷酸盐激酶 (EC 2.7.1.56); PGI, 磷酸葡萄糖异构酶; PMG, UDPGlc 磷酸葡萄糖变位酶 (EC 5.3.1.9); PTS ,磷酸转移酶系统; UGP, 焦磷酸化酶 (EC 2.7.7.9); Fru-bi-P, 果糖 -1,6- - 磷酸盐; Fru-6-P, 果糖 -6- 磷酸盐; Glc-6(1)-P, 葡萄糖 -6(1)- 磷酸盐; PGA, 磷酸葡糖酸; UDPGlc, 尿苷二磷酸葡萄糖。
A. xylinum 能转换各种碳化合物,如已糖、甘油、二羟基丙酮、丙酮酸和二羧酸成为纤维素,通常有效率 50% 。后面化合物进入克雷布斯循环并由于草酸盐脱羧成丙酮酸盐经过糖异生转换到已糖,与甘油、二羟基丙酮类似,并且是戊糖磷酸循环的间体(图 6
纤维素直接前体是 UDPGlc ,是一种常规路径的产物,常见于包括植物的很多生物,并涉及葡萄糖磷酸化到葡萄糖 -6- 磷酸盐 (Glc-6-P), 由葡糖激酶催化,接之这间体向 Glc- α -1-P, 异构化,由磷酸葡糖酸变位酶催化并且后面代谢物由 UDPGlc 焦磷酸化酶转化到 UDPGlc 。这最后的酶似在纤维素合成中介入重要酶之一,因为某些表型纤维素阴性突变物 (Cel) ,特别缺乏这种酶 (Valla et al., 1989 ), 虽然它们表现有纤维素合成 (CS) 活性,纤维素合成的观察方法经过体外证实, Cel 株无细胞提取物来催化 (Saxena et al., 1989 ) 。此外,不同 A. xylinum 菌株之间 焦磷酸化酶活性有变化并且在最有效纤维素产生菌测定有最高活性,如 A. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001 。这后者菌株喜欢果糖作碳源,磷酸葡萄糖异构酶表现高活性,并且具有依赖磷酸烯醇丙酮酸盐 磷酸转移酶系统。这系统刺激果糖向果糖 -1- 磷酸盐转换并促进果糖 -1 6- 二磷酸盐(图 6
7.2 .纤维素合成酶
纤维素在植物和原核生物的生物合成是由尿苷二磷酸盐 (UDP)- 形成 CS 催化的,主要是处置 4- β - 糖基转移酶 (EC 2.4.1.12, UDPGlc: 1,4- β - 葡聚糖 4- β -D- 葡萄基转移酶 ) ,因为它从 UDPGlc 向新形成多糖链连续输送吡喃葡萄糖残余物并所有时间都与这链连接。低聚 CS 复合物常被叫作末端复合物 (TCs) 。它被假设, TCs 首先负责 β -1,4- 葡聚糖链合成,通过外膜挤出(如果是球状, CS 催化域是定位在细胞膜的胞浆侧),并联合和晶体化为明确的超分子结构,跟随头两个过程。
A. xylinum 纤维素合成是典型膜 - 固定蛋白,分子量 400–500 kDa (Lin and Brown, 1989 ) ,并于胞浆膜紧密结合。
因为这个定位, CS 纯化是非常困难的并且膜组分的分离必须在 CS 溶解和纯化之前进行。
而且, A.xylinum CS 表明是一种很不稳定的蛋白 (Lin and Brown, 1989 ) 。从膜分离 CS 是应用洋地黄皂甙 (Lin and Brown, 1989 ) 或是洗涤剂 (Triton X-100) 进行的并用胰蛋白酶处理 (Saxena et al., 1989 ) ,接之在纤维素中截留 CS
按照 Lin and Brown ( 1989 ) 所述,纯化 CS 制剂在三种不同型亚单位中含有,分子量在 90, 67, and 54 kDa Saxena et al. ( 1989 ) 发现只有两型多肽 (83 and 93 kDa). 。这后面结果似更可信,因为这两个亚单位大小与 Saxena et al. ( 1990b , 1991 ) CS 操纵子测定的两个基因 cesA cesB 的大小及由 Wong et al. ( 1990 ) and Ben-Bassat et al. ( 1993 ) 对同样操纵子 (see Section 7.4 ). 报道的基因 bcsA bcsB 是相符的。
光化学亲和研究指出 83-kDa 多肽是一种催化亚单位,显示有高亲和力倾向 UDPGlc (Lin et al., 1990 ) 。根据基因序列,它含有 723 氨基酸残基,多是疏水的。这亚单位可能合成蛋白原,含有单一序列,由 24 个氨基酸残基组成,在制造加工期间截断 (Wong et al., 1990 ) 。成熟蛋白是靠近多肽链的 N- 末端以跨膜螺旋方式在细胞膜固定的。蛋白含有 5 个以上跨膜螺旋线,能相互和与在细胞质中潜入球型区域组成的一大的催化位点相作用。
Brown and Saxena ( 2000 ) 主张 A. xylinum CS 的催化亚单位以同样方式操作次系加工糖基转移酶,即它在纤维素催化配糖直接结合合成,在异头碳构型同时反转来协助,来自 UDPGlc α - 构型,对多糖 β - 构型是单体供体。催活天冬氨酸残基 (D) ,和在许多加工糖基转移酶的球形碎片中发现短序列 DXD QXXRW
(Saxena and Brown, 1997 ) 。在 A. xylinum CS 测到同样运动。在许多配糖合酶这球形碎片有两个区域特征(即由两个区域 A B 组成) (Saxena et al., 1995 ) A 区包括 D 残基,是催化作用的关键,和 DXD 运动,这可能是结合核苷 - 糖的底物。
Brown Saxena ( 2000 ) 近来证实由 A. xylinum CS UDPGlc 结合中这运动的参与,研究应用位点定向诱变得到酶突变。迄今尚不清楚 A. xylinum CS 的球形碎片是由一个还是两个域组成,虽然这第二种可能性更大。然而,已知 A. xylinum CS 催化亚单位是糖基化的。糖基化的两个可能位点在其原发结构中发现,是根据基因排序推测的 (Saxena et al., 1990a )
93-kDa 多肽与催化亚单位紧密结合。它含有单一序列靠近它的 N- 终端和一个跨膜螺旋靠近 C- 终端。这螺旋能固定在细胞膜。多肽可能是一个调控亚单位,与 CS 活化剂 - 环二鸟苷单磷酸 (c-di-GMP) 相互作用 ( 7.5 ) 93-kDa 多肽不与 93-kDa 亚单位抗体结合。但是,尚不清楚 CS 是不是只由两个亚单位组成,因为这低聚复合物有多种作用,即 β -1,4- 葡聚糖聚合作用,细胞外亚纤维挤出,及纤维素带自身组装和晶体化,由微纤维组成。因此, CS 复合物可能包括在跨膜孔形成中涉及的其它多肽中。纯净 CS 显微镜图分析表明酶倾向形成四聚物或八聚物 (Lin et al., 1989 )
 
7.3 .生物合成机制
亚稳定纤维素 I 同质异形的合成,在 A. xylinum 和其它纤维素 - 产生生物,包括植物,至少涉及两个中间步骤,即 (1) 葡萄糖分子向线形 1,4- β - 葡聚糖的聚合和 (2) 单一初始聚合链向超分子结构的组装和晶体化,每种纤维素 - 产生生物的特征。假设 CS 球域是定位在细胞膜细胞质一侧 (see Section 7.2 ) ,还需要 1,4- β - 葡聚糖链通过膜转移到细胞外。所有这三个步骤是紧密相连的,并且聚合速率是受组装和晶体化速度限制的。
 
7.3.1 1,4- β - 葡聚糖聚合机制
细菌纤维素的形成是在 A. xylinum 胞质膜通过 CS 复合物催化结成直线。因为这些复合物能聚合成 200,000 分子量的 Glc s 成为 β -1,4- 葡聚糖链 (Ross et al., 1991 ) ,这过程必须是高强度运行的。这反应机制迄今尚未明确。最近,对在 A. xylinum 机制提出两个不同的假想。
其一,是在 Brown 实验室提出的 (Brown, 1996 ; Brown and Saxena, 2000 ) ,假设 1,4- β - 葡聚糖聚合不涉及一脂间体,从 UDPGlc 把葡萄糖转移到新合成聚合物链。这假设与为无支链同多糖合成负责的糖基转移酶是加工酶的事实一致。 1,4- β - 葡聚糖聚合图示,由 Brown 及其同事提出,见图 7
7 。对聚合反应的一般概念导致 β -1,4- 葡聚糖链生物合成( Brown Saxena, 2000 ;
按这个模式,与其它加工糖基转移酶相似 , CS 催化亚单位的球形碎片中有 3 个催化位点。催化位点之一 (2a) ,由 DXD 基序结合两个 UDPGlc 分子组成(见图 7.1 )第二个催化位点 (1a) ,包括重要天冬氨酸 (D) 残基,在隐袋中催化形成两个 Glc 残基之间 β -1,4- 连接(见图 7.2 ),伴随相关的两个 UDP 分子。第三个位点 (3a) ,含有 QXXRW 基序,牵拉合成纤维二糖还原端(见图 7.3 )。二糖遗留区 1a –2a ,可以结合两个后续 UDPGlc 分子(见图 7.4 )并形成次级纤维二糖分子。接下来,涉及 QXXRW 基序,这第一个纤维二糖分子还原端,被迫向挤出位置。同时,次级纤维二糖分子与(位点 1a D 残基的协助)初始非还原端结合,得到纤维四糖。被清除的 1a –2a 区可以结合两个后续 UDPGlc 分子,去重复反应循环,在链上附着两个以上葡萄糖残基。这聚合作用模式简化表见图 8
按这模式,新合成 β -1,4- 葡聚糖链开始形成它的还原端挤出。
8. Brown 模型细菌纤维素生物合成简化表( Brown Saxena, 2000 )。
Koyama 等人 ( 1997 ) 研究证实了这模型。作者证明葡萄糖残基是附加于多糖非还原端的,初生聚合链还原端位置是远离细胞的。而且,在纤维素分子中两个邻近葡萄糖残基之间是扭曲角是 180° ,在生长链附加纤维二糖残基(而不是单一葡萄糖部分有助于维护) β -1,4- 葡聚糖双重螺旋轴 (Brown, 1996 ) 。还有 Kuga Brown ( 1988 ), 应用银标记,证明纤维素从它的还原端开始链被挤出细胞外。
Han and Robyt ( 1998 ) 应用 A. xylinum ATCC 10821 株研究了细菌纤维素合成(静止 C 跳动并与 D- 葡萄糖和细胞和膜制备追逐反应)应用 UDPGlc, 分别提出额外的,程序不同分子机制。他们认为活化的葡糖吡喃糖(来自 UDPGlc )连贯残基被联接到生长纤维素链的还原端,因为得到从纤维素链挤出还原端的 D-[C] 葡糖醇与 D-[C] 葡糖醇的比率是随时间而减少的。 Han Robyt 假定脂焦磷酸盐和类萜特性是生物合成部分。按他们的观点,在细菌纤维素合成期间脂间体的形成由脉冲 C 标记和氯仿和甲醇混合物提取物多达 33% 来证实。它的定量提取是不可能的,因为当多糖链长超过 8–10 糖部分,含脂复合物在提取混合物中变得不能溶解。
Han Robyt 提出,细菌纤维素生物合成在胞浆膜涉及三种酶嵌入: CS, 焦磷酸脂: UDPGlc 磷酸转移酶 (LipPP:UDPGlc-PT), 和焦磷酸脂磷酸水解酶 (LPP) 。其反应机制作者称为嵌入反应,在图 9 提出。
9 。细菌纤维素合成机制涉及脂间体 (Han and Robyt, 1998 ; ) Lip 、脂; P. 磷酸; Rib D- 核糖; U, 尿苷;葡糖残基; LP: UDPGPT, 焦磷酸脂; CS; 纤维素合成酶; LPP ,焦磷酸脂磷酸水解酶。
这第一种酶从 UDPGlc 转移 Glc- α -1-P 到单磷酸酯 (Lip-P), 这样就得到焦磷酸脂 - α -D-Glc (LipPP- α -Glc)( 9 反应 1) 。在端基碳 α 结构涉及 Glc 磷酸酯结合,与基底分子的残留相同。这反应的次级产物是 UMP (按 Brown 氏模型 UDP 释放)。
接下来的反应(反应 2 ,图 9 ),由 CS 催化,葡萄糖残基从一 LipPP- α -Glc 分子转成另外一种和两个葡萄糖残基之间形成 β -1,4- 糖苷连接,由于它们之一 C-4 羟基组附着在次级葡萄糖(来自次级 LipPP- α -Glc C-1 羟基组。
在第三个反应(反应 3 ,图 9 ),在前步发生形成焦磷酸脂的水解和另外从 UDPGlc 得到的 Glc- α -1P 能附着于在这反应中释放的 LipP 。这 3 个反应循环连续得到一适宜长度 β -1,4- 葡聚糖链。这机制包括从一葡萄糖残基 LipPP- α -Glc 分子的端基碳结构转移从一 LipPP- α -Glc 分子到另外一种,或是到纤维二糖、丙糖、四糖,和随后到 n - 糖。一 β -1,4- 葡聚糖长链的受体,始终是单一 α -D- 葡萄糖残基,于聚合系统中存在的两个 LipPP 分子中的一个相连接。这意味着,来自位于远离细胞的初始纤维素链的还原端和非还原端的链发生延长,这与 Brown 模型是相矛盾的。按 Han Robyt 氏模型两者之间有两个协同 LipPP 分子和 CS 复合,不是处理糖基转移酶,是植入细菌的胞浆膜。
在纤维素生物合成中脂间体的参与从 Agrobacterium tumensefaci (土壤杆菌) (Matthyse et al., 1995 ) 、及 Salmonella (沙门氏菌) O- 抗原多糖 (Bray and Robbins, 1967) Xanthomonas campestris 黄单胞菌)胞胶 (Ielpi et al.,
1981 ) 得到证实。而且,这脂间体还涉及 acetan 的合成 (De Lannino et al., 1988 ), 在许多 A. xylinum 菌株, 这是一种与纤维素一起产生的可溶多糖(见 7.6 段)。为了阐明脂间体在纤维素形成中是否起作用已在深入研究,这是由 Han Robyt ( 1998 ) 提出的假设。相反, Brown 氏设想 (1996, 2000) ,由体外纤维素合成已证实,溶解的 A. xylinum 膜制剂用洋地黄皂苷催化 (Lin et al., 1985 ; Bureau Brown, 1987 ), 和通过提纯 CS 亚单位合成聚合物 (Lin Brown, 1989 ), 不包括脂成分。
按照提出的两个假想细菌纤维素合成不需要任何原始物,与早时减免是相一致的 (Canale-Parda and Wolfe, 1964 )
7.3.2 .纤维素链的组装和结晶
吡喃葡萄糖分子到 β -1,4- 葡聚糖的聚合,无论是什么机制,这是纤维素合成最复杂阶段,在细菌也是如此。纤维素独特的机构和特性,都是源于此。再导致深入阶段:就是链被挤出并在细胞外组装,得到超分子结构。在这些过程中最重要的是细菌纤维素的多聚复合物的特异结构,固定于细胞质膜。在 A. xylinum 细胞,这些复合物是沿着细胞长轴呈直线排列和一个细胞可容纳 50–80 植物细胞 (Brown et al., 1976 ) ,而在维管植物的组织细胞特征是 6 重对称花结 (Brown and Saxena, 2000 )
 
更多地充气,即在 A. xylinum 培养期间搅拌,或是加入某些物质,它不能渗入细胞内,但能与 β -1,4- 葡聚糖链竞争氢键(即羧甲基 - CM - 纤维素,荧光增白剂),能引起纤维素链超分子结构的明显改变,和替代带状聚合物,即相对稳定纤维素 I (图 10 ),原纤维与 CS 复合物同线并集成一行,第二,形成热力更稳定同质异形纤维素 II
形成同质异形无定形纤维素 II 。这现象是组织细胞线性排列紊乱有关。 Brown Saxena ( 2000 ) 对这个问题的论述,这情况取决于最终产物的形态,在胞质膜组织细胞排列起一定作用,虽然他认为与某些藻类相反, A. xylinum 这些复合体有稳定特性 (Kudlicka, 1989 ) 。值得一提的是在细菌纤维素合成期间 A. xylinum 细胞运动著名现象,使纤维素链挤出 (Brown et al., 1976 ) A. xylinum 细胞的反转运动能计算出典型链伸展率, 每小时和每个细菌细胞
,这相当于 2 µm 分和相对于 8 一聚合物比 10 个葡萄糖分子成为 β -1,4- 葡聚糖还要大。如果这强势与亚纤维组装成束或带有关,强到足以转换所有 A. xylinum 细胞运动,这些力就可以很好影响 CS 亚单位空间排列,定位在膜的半液体脂双层中。
10. A. xylinum 纤维素亚纤维构造模式: 1 ,脂多糖层, 2 ,壁膜间隙, 3 ,原生质膜, 10 nm 微粒, CS 亚单位 (Kudlicka, 1989 )
β -1,4- 葡聚糖链空间组装有分层特性 ( 10 ) 。在第一步, 10-15 个初期 β -1,4- 葡聚糖链形成一个亚单位(也叫原微纤维),直径 1.5 nm ,不是棒样机构,而是左转三螺旋 (Ross et al., 1991 ) 。亚纤维聚集物(扭曲)构成大量平行链组成微纤维。接下来是分层结构,是微纤维束,接下来是松散绕带,大约 1000 个单独 β -1,4- 葡聚糖链组成 (Haigler, 1985 ) 。在有 Calcofluor (荧光增白剂)存在时,渗透进细胞包膜的外膜并与原微纤维形成复合物,它们聚集成微纤维就停止了。在有非常大的分子存在时,像 CM- 纤维素和木葡聚糖 (Yamamoto et al., 1996 ), 非常大穿过膜,装配成微纤维束和带,被分裂,于是表明这后两种结构形成排出纤维。 Ross 等人 ( 1991 ), A. xylinum 纤维素链结构联合分析,由 Bayer ( 1979 ) 首先报道在细菌细胞中存在,强调在细胞被膜内外膜附着特殊位置的重要作用。它们的发生就能使纤维素微纤维有了出口,不用与任何肽聚糖凝胶的相互作用,它们充满壁膜间隙。它们的相互作用能防止原微纤维之间调整氢结合的形成。
 
分子的孔洞结构,是否能使 A. xylinum 纤维素微纤维移动通过到细胞外,仍不知晓。属于 CS 操纵子(见 7 4 段)的 bcsC bcsD 基因表达产物的参与, 在它们的形成中不能排除 (Wong et al., 1990 ), 这些表达产物表明对纤维素内部合成是越发至关重要 (Ben-Bassat 等人 ., 1993 ) 。还有三种蛋白作用: CSAP20, 54, 59 CS- 协同蛋白),必须详查。它们与纤维素结合与 CS 催化亚单位一起,在 CS 提纯试验中揭示 (Benziman Tal, 1995 ) 。可能,导致纤维素合成的复杂机制的其它成分分离和纯化,与 A. xylinum CS 操纵子的基因直接突变一起,可以有助阐述这些步骤在分子水平发生次序。
初始纤维素链组装过程与亲本 A. xylinum 细胞密不可分,展示一种独特和显著动力学。这些链的挤出及其组装成有序结构,是通过细胞运动反转辅助的。自始至终, β -1,4- 葡聚糖合成和释放全过程, A. xylinum 细胞沿着自身轴心转动(伸展运动) (Brown 等人 1976 ) 。还有,这运动是由带状物扭曲形式驱动的,停在挤出点,定位在延长细胞侧面。这些扭曲物在电子显微镜下明显可见。
7.4. 纤维素生物合成的基因原理
纤维素生物合成涉及几种酶。它们的功能是从指导纤维素前体 UDPGlc 合成开始的,随后单体聚合。发现初期反应是由葡糖激酶,葡萄糖磷酸变位酶和 UDPGlc
焦磷酸化酶催化的,不限制细菌纤维素合成最终速率,因为 A. xylinum 合成过量 UDPGlc (Ben-Bassat 等人 ., 1993 ) 。细菌纤维素合成速率是由二鸟苷酸环化酶和低聚物, CS 调控复合物来控制的。因此,更有效产生纤维素 A. xylinum 突变株的结构,需要检测对这些酶的基因编码图表。这已由 Wong 等人 . ( 1990 ) Ben-Bassat 等人 ( 1993 ) 研究,已证明,细菌纤维素生物合成涉及 4 个耦合基因: bcsA (2261 bp), bcsB(2405 bp), bcsC (3956 bp), bcsD (467 bp), 形成 CS 操纵子,长度 9217 bp ,和同时转录为多顺反子 mRNA (信使核糖核酸)。
 
虽然由各基因编码蛋白功能,迄今尚未明确测定,有关其作用的某些信息,已由基因互补试验得出 (Wong et al., 1990 ) 。这些研究结果指出, CS- 缺陷株能由基因 bcsB 补充, 85-kDa 蛋白( 802 氨基酸残基)指定编码, A. xylinum 突变株 CS 和二鸟苷酸环化酶缺陷,由基因 bcsA 补充,为 84-kDa 蛋白( 754 氨基酸残基)编码 (Ben-Bassat et al., 1993 ) 。根据不同的突变株可推断 CS 复合物和 c-di-GMP 相互作用在蛋白 A 应用部分,是 CS 异构催化,早期由 Saxena 等人假设 ( 1991 ) 。蛋白 B 能结合 UDPGlc 并合成 β -1,4- 葡聚糖链。催化亚单位 (cesA) 基因编码与基因 bcsB 相似 (Wong 等人 ., 1990 ; Ben-Bassat 等人 ., 1993 ) ,另外 Saxena 等人描述,一年之后对调控亚单位 (cesB). 鉴定了基因编码。
但是, Saxena 等人 ( 1990a , 1991 ) 推测 CS 操纵子头两个基因位置是对立的,并且 CS 催化亚单位是第一个基因编码。在 bcsC bcsD 两种基因表达产物的作用,尚未明确测定。这些基因也可能是膜定位蛋白(分别是 141 17 kDa )的编码,及在内部纤维素合成和从细胞分泌蛋白两者都是必要的。 Ben-Bassat 等人( 1993 )报道, bcsD 基因分裂或缺失能明显减少纤维素合成。 Saxena 等人 ( 1990a ) Ross 等人 ( 1991 ) 预计在 CS 操纵子,一些基因存在,能控制纤维素链组装。
还不清楚,在细菌纤维素合成中如果有质粒参与,就是,它能起什么作用。如果能证明,在 A. xylinum ATCC 10245 ( 通常 17005) 株的突变物 60% 质粒检测了组成和大小,是用 N - 甲基 -N - 硝基 -N- 亚硝基胍诱变的 , 它们与野株有明显不同。这些观察提示,质粒结构和细菌纤维素合成之间似有连带关系。
移动的 DNA 碎片,包括插入序列 (IS) ,特别在原核生物广泛分布,在长 750–2500 bp(Galas Chandler, 1989 ) ,在许多基因调控是重要因子。 ISs 可以激活或灭活基因,并且可以启动 DNA 重新排列,像删除,倒置和整合。表明, ISs 参与 Pseudomonas atlantica (假单胞菌属) (Bartlett Silverman, 1989 ), Xanthomonas campestris (黄单胞菌属) (Hotte 等人 ., 1990 ), Zoogloea ramigera (粘液菌属) (Easson 等人 , 1987 ). 细胞外多糖合成的调控。它也有可能参与细菌纤维素合成的调节。
A. xylinum 插入序列已能很好识别 IS 1031 (950 bp, 和已知核酸序列 ) 。在大多细胞突变株与野株相比测到 IS 1031 外形改变。某些重组包括两个或更多 IS 1031 碎片。 Coucheron( 1991 ) 观察到 IS 样品有更多明显改变,针对 DNA 重新排列并设法从灭活基因得到的分裂额外 ISs 之逆转株和得到假逆转株,在培养基表面产生蜡样物质,但纤维素合成能力不能修复。这些试验指出,有 ISs 存在有助于 A. xylinum . 的不稳定性。
 
 
7.5. 细菌纤维素合成调节
- 3,6 :3 6 二鸟苷单磷酸 (c-di-GMP, 见图 11 ) A. xylinum CS 可逆变构催化剂并且在完整 β -1,4 葡聚糖生物起源调节起重要作用 (Ross 等人 1987 ).
11. c-di-GMP – 结构 A. xylinum CS. 变构催化剂
这化合物与酶调节亚单位结合,并诱生构象改变,促进 CS 原聚体联合并导致反应增强 (Ross 等人 1987 ).
A. xylinum 细胞中 c-di-GMP 浓缩是由三种酶调控的:二脒基环化酶 (CDG), 磷酸二酯酶 A (PDEA) 和磷酸二酯酶 B (PDEB) ( 12 ) (Ross 等人 1987 ). PDEA PDEB 定位胞质膜,并且 CDG 有两种形式。
其一是定位胞质膜和另外一个运行于胞质中 (Ross et al., 1991 ) 。最近, Weinhouse 等人 ( 1997 ) 报道一新的 c-di-GMP- 结合蛋白,大概也能参与细胞内游离 c-di-GMP 浓缩。 Tal 等人( 1998 )证明,在 A. xylinum c-di-GMP 细胞反转是由三个操纵子控制的。
 
12. A. xylinum 纤维素合成提出的模型。为简单起见,描述了单一 β -1,4- 葡聚糖链的合成,虽然 CS 更复杂形,是同时聚合数个链,在纤维素生物原中或许可激活酶单位 (Ross et al., 1991 ; with kind permission) PDEA ,磷酸二酯酶 A PDEB, 磷酸二酯酶 B pppGpG, 二磷酸 -di-GMP; pGpG (II), c-di-GMP (cyclic-di-GMP);pGpG, di-GMP ( 线型 di-GMP).
CDG, A. xylinum 纤维素合成系统中的关键调节酶,由两个多肽链和两个基因编码组成 (Nichols Singletary, 1998 ) CDG 由镁离子活化和特定受皂素抑制 (Ohana 等人 1998 ) ,是一种糖基化的类萜。 CDG 转换成两个 GTP 分子首先进入线型 (pppGpG) 和然后进入环 (c-di-GMP) 单磷酸二鸟苷酸,活化 CS PDEA 分裂物激活 c-di-GMP 进入线型灭活二聚物 (pGpG, di-GMP), PDEB 进一步分解成两个 5 GMP ( 12 ) 分子。 PDEA 受钙离子抑制,但不影响 PDEB 。因此,浓缩物间接影响纤维素合成速率。这些钙离子高浓度能增强这速率,后来 c-di-GMP 转换非活性线型被抑制。
 
相信 CS 分子实情是受 c-di-GMP 激活的及它合成调节涉及 CDG 正面影响和 PDEA PDEB 的负面影响,这是其独有特征。迄今,有关纤维素合成调控机制只是在 A. xylinum 发现
7.6. A. xylinum 可溶多糖合成
除了纤维素之外,某些相关可溶多糖也可由 A. xylinum 合成。
1970 年代,测到一种可溶 β - 匀质葡聚糖。它主要是由 β -1,4- 链接葡萄糖残基和这链每第三个葡萄糖部分有另外一个葡萄糖亚单位是由 β -1,2 链接的 (Colvin and Leppard, 1977 ; Colvin et al., 1979 ) A. xylinum 纤维素不形成菌膜 (Pel) 株合成 α - 葡聚糖与细胞被膜相连 (Dekker 等人 1977 ) Valla Kjosbakken ( 1981 ) 分离了从培养基中分离到一可溶多糖含 Glc, Man, Rha, 和葡萄糖醛酸残基(各自克分子比率 3:1:1:1 )。所述聚合物由相同部分(改变各自克分子比率 6:2:1:1 )组成,由另外细胞株合成,是由 Minakami 等人测到的 ( 1984 )
这些聚合物某些残基可能被乙酰化 (Tayama et al., 1985 )
这型多糖常用名乙酰素( acetan (De Lannino 等人 1988 )
此外,某些 A. xylinum 野株也能合成类似可溶多糖 (Glc, Man,Rha, 葡萄糖醛酸,各自 6:1:1:1) 和纤维素 (Savidge Colvin, 1985 )
问题是纤维素伴同可溶多糖在其生物合成中起什么作用。看来它不起任何直接作用,即使生物合成动力学与纤维素是相同的 (Marx-Figini and Pion, 1974 ) ,而且 UDPGlc 优先用于这些可溶多糖产生代替纤维素产生 , (Delmer, 1982 ) 。某些作者叙述内部初始纤维素微纤维,由非晶体物质包裹 (Leppard et al., 1975 ), 可由上述可溶多糖组成。在静止培养基液体部分这些可溶聚合物缺失及其纤维素膜存在证实了这个设想 (Valla Kjosbakken, 1981 ).
更早, Ben-Hayyim Ohad 1965 年揭示,在培养基中存在 CM- 纤维素,用于细菌纤维素合成,导致纤维素这种可溶衍生物合进聚合物微纤维中。然而, A. xylinum 外多糖结合进入纤维素微纤维尚未观察到。
7.7. A. xylinum 内和外纤维素酶合成的作用
有关 A. xylinum 纤维素酶开始报告是由 Okamoto 等人 ( 1994 ) Standal 等人 ( 1994 ), 各自发现的,包括对其基因的描述。初期的作者从 A.xylinum IFO 3288 DNA 基因库选择一个基因为 24-kDa 蛋白( 218 个氨基酸残基)编码,显示 CM 纤维素酶活性。 Standal 等人 ( 1994 ) A. xylinum ATCC 23769 细胞突变株发现另外内纤维素酶基因,定位在 CS 操纵子上部。显示从基因分裂产生纤维素酶合成能力丧失。
Tonouchi 等人 ( 1997 ) 的结论,研究 A. xylinum BPR 2001 -1,4- β - 葡聚糖酶基因的定位,是相似的。这后者基因是定位在 CS 操纵子上部,而第二个纤维素分解酶基因,是由这菌株产生的,即外 -1,4- β - 葡糖苷酶,在这操纵子下部发现。
A. xylinum BPR 2001 - - 纤维素酶已被提纯和描述特征 (Oikawa 等人
1997 ; Tahara 等人 , 1998 ) Tahara 等人研究( 1997 )还报道, pH 5.0 是细菌生长和细菌纤维素合成的最佳条件,两种细菌纤维素酶活性比在 pH 4.0 高几倍,这时细菌纤维素产生稍降低。还观察到,在 pH 5.0 ,在培养期间平均 DP 16,800 降到 11,000 ,而在 pH 4.0 ,这些改变可忽视。在 pH 5.0 得到纤维素物理特性差,即是,低抗拉强度(低 Young 弹性值)。
这些结果及纤维素酶和 CS 操纵子基因定位,提示在 A. xylinum 纤维素生物起源涉及内 - 1,4- β - 葡聚糖酶和外 -1,4- β - 葡糖苷酶 (Tahara, 1998 )
特别是,在生长后期合成中,它可能与初始 β - 葡聚糖链降解有关。而且, A. xylinum BPR 2001 -1,4- β - 葡糖苷酶显示在水解和转糖基活性两方面 (Tahara et al., 1998 ) ,与其它糖苷酶相似,在端基碳结构不引起倒置。这后者活性可对聚合物平均 DP 内部改变负责,然而,必须进一步研究去解释这设想。对这可能性的初步证据是黄豆细胞试管培养的表现。其 β - 葡糖苷酶活性,还有转糖基活性,加之细胞长度增加,因为这种酶特别参与在半纤维素前体糖苷残基转移到细胞壁的生长末端,这里发生多糖集中合成 (Nari et al., 1983 )
无论 A. xylinum 纤维素酶是否涉及在饥饿期纤维素形成释放储备能量,这一直是待解答的问题,虽然有些研究证实了这论点 (Okamoto et al., 1994 ) 。已知某些菌核内 -1,3- β - 葡聚糖酶也在起作用 (Jones et al., 1974 )
最近观察指出,细菌纤维素的物理特性和 DP 的改变,应用一些化合物影响其生物合成,或是用 A. xylinum 纤维素酶开发其活性和特异性已获得成功。
8. 细菌纤维素的生物降解
无论它的起源如何,纤维素都能彻底自然降解。
然而,与植物纤维素相比,有关两者聚合物都易降解,像半纤维素和果胶,木质素,是最耐久的植物聚合物,细菌纤维素相对纯净并更易受水解纤维素酶的攻击,这酶主要由真菌和许多细菌产生。在这方面,细菌纤维素的商业应用对环境是无害的。
而且,细菌纤维素的结构和特性(大到表面区)使它能作为纤维素酶( 1,4- β - 葡聚糖 4- 葡聚糖水解酶 , 之前 细胞内酶 , EC 3.2.1.4 )和纤维素生物水解酶(纤维素 1,4- β - 纤维素生物水解酶, EC 3.2.1.91 ),这是纤维素体罚主要部分,从纤维素水解菌及纤维素分解真菌系统得来特异多酶粒子。
近来, Boisset 等人( 1999 )证明 Clostridium thermocellum 纤维素体比微晶 Valonia ventricosa 纤维素分解 A. xylinum 纤维素微纤维更快。应用传动电子显微镜,红外光谱和 X- 线衍射分析,对水解过程超微观察指出,细菌纤维素快速水解是纤维素体架构中存在的各种酶成分高效协同作用的结果。 Boisset 等人( 2000 )进一步研究表明 Humicola insolvens 纤维素生物水解酶 Cel7A ( 之前 CBH I) 致分散细菌纤维素带薄化,而 Cel6A (CBH II) Cel7A ( 各自比率 2:1) 的化合物把带切成更小的片,于是提示部分 CBH II 攻击的内方式。几年来已知某些外切葡糖聚酶低固有内活性现象,并与内切葡糖聚酶比较说明纤维素生物水解酶的相同作用更有效 (Teeri, 1997 ) 。按目前观点,多样内切和外切纤维素酶系统,细菌纤维素体和真菌纤维素水解复合物两者,代表完美平衡连续活性,为各种纤维素基质提供有效降解。
 
Samejima 等人 ( 1997 ) 观察到细菌纤维素对纤维素酶的敏感性,发现 Trichoderma viride CBH I 和内切葡聚糖酶 II 的混合物,彻底分解微纤维束扭曲和弯曲带样结构成线针样微晶体,并且还引起聚合物快速破碎。细菌纤维素丝带盘绕结构转变为针样,是由基片非凡盘绕动作驱动的,可能是张力释放的结果,当纤维素酶使微纤维质降解成更短的碎片。 Samejima 等人 ( 1997 ) 还测到,酸处理细菌纤维素,含有许多微纤维凝聚物,对两种酶攻击不敏感。
Srisodsuk 等人 ( 1998 ) 也得到类似结果,用 Trichoderma reesei CBH I 消化微晶细菌纤维素并观察到这聚合物迅速溶解,但它的 DP 缓慢下降。从这微生物得到的内切纤维素酶以相反的方式攻击这基质。
两种酶水解棉花纤维素比细菌纤维素更缓慢,尽管棉花纤维素与其它植物相比表明有相当高纯度。
细菌纤维素对纤维素酶的攻击敏感的原因之一,是它有大的表面区,实际上增强全面水解和促进纤维水解酶有效结合,这是降解过程重要步骤。这结论是基于 Palonen 等人 ( 1999 ) 研究,发现许多 T. reesei CBH I CBH II 分子与细菌纤维素链接,增强了水解作用。而且, CBH II 结合明显更强(从基质得到的酶吸附/脱吸附, 60–70% 磁滞来辅助),指出这酶明确的不同处理特性。
 
Stalbrandt 等人 ( 1998 ) 比较了四种 Cellulomonas fimi (纤维素菌属)内切 - 和外切 - 纤维素酶抗微晶细菌纤维素和酸胀 Avicel (结晶)纤维素的攻击模式。
后者对所有酶分解更有效。在多数情况观察到 45–65% 溶解和 DP 下降, Cbh B 例外,引起 27% 溶解。已知加工酶 Cbh A, 达到高度细菌聚合物溶解 (67%) Stalbrandt 等人 ( 1998 ) 的结果证明只是细菌纤维素原纤维外表面接触 C. fimi 纤维素酶因为 Cbh A 是处理酶,它比另外三种纤维素酶清除外部原纤维更迅速并且可攻击聚合物更深内表面。因此,其它酶(两种非加工内切纤维素酶和 Cbh B ,显示更弱加工特性)不能有效溶解细菌纤维素。
而非结晶溶解纤维素对这些都同样有效。
 
近来研究指出高度结晶细菌聚合物完全消化不会引起任何问题,在自然环境中产生的大量各种各样内切 - 和外切 - 纤维素酶对细菌纤维素生物降解的生物应答,它们互相活性补充。而且,与之相对的植物原纤维素,需要预处理,以保证酶容易转换糖,细菌纤维素能直接被纤维素酶消化。
9. 生物技术生产
为了达到细菌纤维素的高生产率和收量和降低其生产成本,要特别强调以下方面:
提供选择 A. xylinum 菌株筛选方法的开发,能从各种廉价废物碳源有效生产纤维素,从筛选得到的野株应用基因工程方法得到改善, A. xylinum 的最佳培养条件(静止和搅拌培养、发酵罐型),细菌纤维素的形状(菌膜或是无定型凝胶)和特性(恢复力、弹性、机械强度、吸收能力)的测定,必须适合进一步聚合物应用、培养基成分的优化(碳和氮源、生物合成促进化合物、微量元素等)工艺条件( pH 、温度、通气)。
这些将在后面讨论。
 
9.1 .细菌纤维素产生株的天然分离和改良
选择适宜 A. xylinum 株的方法之一是从一些菌株来筛选,不能氧化葡萄糖由葡糖酸到 2-, 5-, 2,5- 酮葡糖酸 (Winkelman and Clark, 1984 ; Johnson and Neogi, 1989 ; De Wulf et al., 1996 ; Vandamme, 1998 ) 。在这方面和 BrO 离子, De Wulf et al. ( 1996 ) 应用一种含 Br 的琼脂营养培养基结合酸性 pH 以释放对 A. xylinum 细胞有毒的 溴分子。只是这些突变体,不能把葡萄糖转变成葡糖酸或其衍生物,能存在于培养基之中。
Vandamme et al. ( 1998 ) 成功应用这种方法去分离 A. xylinum KJ33 株,能产生 3.3 g 纤维素 L . A. xylinum 菌株,不能代谢培养基含有的葡萄糖成葡糖酸 (Johnson and Neogi, 1989 ) 。另外一些酸,能从 CaCO3 选择的方法避免葡萄糖向有机酸的转换,选择有缺失葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶突变,在搅拌培养中完成。为相同目的,即最好纤维素产生株的筛选,已应用向生长培养基中加入纤维素酶的方法 (Brown, 1989c )
 
用化学化合物突变,如 N - 甲基 -N - 硝基 -N- 亚硝基胍或乙基甲烷磷酸盐,以及用紫外光照射得到突变物,显示有更高的纤维素产生力,减少可溶多糖腊脂合成和非常低级葡萄糖向有机酸的转换 (Johnson and Neogi, 1989 )
A.xylinum 菌株的筛选还有随意分离或诱生纤维素 II- 产生突变的目的。这种纤维素是由细菌合成的,形成光滑菌落并且不能在营养培养基表明产生薄膜。相反,聚合物是分散在整个培养基容积之中的。
 
最好的细菌纤维素产生筛选也有传统操作,是用个别单独培养的合成物活性测定的。例如, Toyosaki et al. ( 1995 ) 从大量植物(水果,花卉)样本分离 2096 醋酸菌株和在营养培养基表面形成膜的 412 株进行深入研究。
产生 A. xylinum ssp. Sucrofermentans BPR2001 – 菌株的过程,是在搅拌培养中有效合成细菌纤维素的。
9.1.1 .应用基因工程改良纤维素产生菌株
除了 A. xylinum 以外微生物的各种糖酶基因密码表达,增加可利用碳源的范围,可以增加细菌纤维素的产量和降低培养基价格。以醋酸菌属的 Leuconostoc mesenteroides 基因蔗糖磷酸酶表达为例 (Tonouchi et al., 1998 ) ,利用蔗糖作为碳源和增加纤维素产生。此外, Nakai 等人( 1999 )在 A. xylinum 株从绿豆 (Vigna radiata, Wilczek) 基因突变蔗糖合成酶表达的方法得到双倍纤维素产量。突变酶,这 11 丝氨酸残基,由谷氨酸替代 (S11E); 这引起工程酶对 UDPGlc 合成中蔗糖和有助糖裂解有更高亲和力。突变基因引入 A. xylinum 在重组株改变了蔗糖代谢,但针对 UDPGlc 合成也建立了一新路径 (Figure 13 ) 。能量操纵这过程是葡萄糖的糖苷键裂解而不需要任何其他能量投入,这是 UDPGlc 由常规路径合成时的情形。此外,在葡萄糖聚会过程产生的 UDP 分子能直接通过蔗糖合成酶活性再利用,观察到偶联反应速率增加和纤维素合成有更高比率。应该强调在高等植物 UDPGlc 合成具有两个系统。
13. A. xylinum 重组株的 UDPGlc 生物合成途径包括蔗糖合成酶 (SucS) 基因。其它缩写与图 6 相同,(见 7.1 段)。
9.2. 发酵生产
液体培养基表面生长和皮样垫胶状物形成是 A. xylinum 菌株的天然特性。
因此,静止状态似乎是细菌纤维素合成的最佳条件。然而,静止培养的主要缺点是,如在聚合物形成,只是能形成膜片和有相当低的生产力,应该促进新发酵工艺的发展。
9.2.1 . 碳和氮源
在细菌纤维素生产收量的影响因素研究中,多集中在碳源。多在单、双和多糖、乙醇、有机酸和其它成分,相比 Jonas Farah ( 1998 ) 发现首选碳源是 D- 阿糖醇和 D- 甘露醇,而结果与葡萄糖相比是各自产生高达 6.2 3.8 倍纤维素。这两种糖醇在整个培养期间提供了 pH 稳定性,因为它们不能转换葡萄糖酸。
Tonouchi 等人 ( 1996 ), 应用一 A. xylinum 菌株从葡萄糖和果糖得到纤维素,发现果糖刺激 磷酸葡萄糖异构酶和 UDPGlc 焦磷酸化酶活性,因此增加纤维素的收量。
当在营养培养基 (Masaoka, 1993 ) 中麦芽糖是唯一碳源时,细菌纤维素的产生比含葡萄糖培养基低 10 倍和聚合物比有葡萄糖 (DP=11,500) 存在明显更短 (DP=4000–5000)
Matsuoka 等人 ( 1996 ) 研究了使用 A. xylinum ssp. 乳糖发酵 BPR2001 菌株在搅拌培养中纤维素合成并发现在生长培养基中有乳酸存在能刺激细菌生长和提供纤维素收量 4--5 倍。乳酸的来源通常是玉米浸泡液 (CSL), 它是细菌纤维素生产应用培养基的主要成分,特别是在搅拌培养。与葡萄糖和果糖相比,乳酸不能转换 UDPGlc, 但在柠檬酸循环中经丙酮酸和草醋酸代谢,这是纤维素产生的能源。向生长培养基中提供乳酸,可进行乳酸菌和醋酸菌的混合培养。使用 Lactobacillus , Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus 菌株得到最好结果。乳酸菌和醋酸菌在有蔗糖水解物酵母 ( β - 呋喃果糖苷酶产生物 ) 存在也能生长。这方法提供细菌纤维素高收量,在搅拌培养 14 天之后得到,纤维素 8.1 / (Seto et al., 1997 ) ,乳酸菌株,只有 6.4 / 升。
纤维素合成刺激化合物之一好像是乙醇 (Naritomi et al., 1998 ) A. xylinum 在含果糖培养基中连续培养,显示 10 乙醇 / 升,增加细菌纤维素收量,但浓度在 15 / 升则阻止聚合物合成。这些结果提示与乳酸类似,乙醇也是一种能源(积聚 ATP )并不是纤维素合成的基质。 ATP 激活果糖激酶和抑制葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶,因此阻止 6-P- 葡萄糖向 6- 磷酸葡萄酸转化,可推断,由于这些偶联反应 - 果糖总量深入异构化至葡萄糖 -6- 磷酸增加。
 
每个产生纤维素菌株都需要一特殊复合碳源,不仅要提供氨基酸、还有维生素和无机盐。这些需求可使用酵母提取物、 CSL 及酪蛋白和其它蛋白水解物来满足。首选氮源是酵母提取物和蛋白胨,由 Hestrin Schramm ( 1954 ; H-S medium) 开发了典型培养基的基本成分,应用于大量细菌纤维素合成研究。但是,在搅拌培养多推荐的碳源是 CSL(Johnson and Neogi, 1989 ) 。还发现,在昂贵培养基成分的主要部分,即酵母提取物和细菌蛋白胨,能用 CSL 或包心菜汁代替。还有工厂废弃物质,如甜菜糖浆,从淀粉水解物分离葡萄糖之后的废液以及乳清和某些工业发酵废物(即用乙醇沉淀右旋糖酐之后的废液)是适宜的培养基成分 (Krystynowicz et al., 2000 )
在细菌纤维素合成中维生素的影响研究 (Ishikawa et al., 1995 , 1996b ) 表明有最大促进有吡哆醇、烟酸、对氨基苯甲酸和生物素,并且甚至 CSL 培养基也能用这些物质强化。也鉴定出某些其它成分,也能强烈刺激 A. xylinum 菌株产生纤维素,像胆碱 asjunz 衍生物、甜菜碱和脂肪酸(盐和酯类) (Hikawu et al., 1996 ) 。应用最佳生长培养基成分能达到高细菌纤维素的产生(至 25 / 升)是通过数学法和计算机分析设计的 (Joris et al., 1990 ; Embuscado et al., 1994 ; Vandamme et al., 1998 ; Galas et al., 1999 )
9.2.2 . pH 和温度影响
pH A. xylinum 纤维素产生和特性的影响分析指出,最佳 pH 取决于菌株和通常变化在 4.0 7.0 之间。 (Johnson and Neogi, 1989 ; Galas et al., 1999 ). 例如, Ishikawa 等人 . ( 1996a ) Tahara 等人 . ( 1997 ), 应用两个不同的 A. xylinum 菌株,在 pH 5.0 观察到产生聚合物最高。 Krystynowicz 等人 . ( 1997 ) 也发现在同样 pH 最理想。在不同 pH 所得聚合物的吸附特性比较,这些纤维素是在 S-H 培养基中 pH 4.8–6.0 积聚的,表现有最高水结合能力 (Wlochowicz, 2001 ) 。除了培养基的 pH 之外,还有温度在影响细菌纤维素的收量和特性。大量的试验报道温度范围在 28-30°C ,并且它的变化能引起纤维素 DP 和水结合能力的改变。例如,在 30 °C 与在 25 35°C 细菌纤维素的合成产生比较有较低 DP (约 10 000 )和更高水结合力 (164%)(Wlochowicz, 2001 )
9.2.3 . 静止和搅拌培养;发酵罐型
细菌纤维素合成无论是运行在静止培养还是沉没状态,提供适当搅拌和充气,对于培养基的匀质和有效质量转移都是必要的。培养条件的选择完全取决于聚合物用途和目的。
在静止培养中产生的纤维素主要取决其表面 / 容量比率。最佳表面 / 容量比率可以不受非常高(不必要)或是非常低的充气(细胞生长和纤维素合成终止)的影响。报告表面:容量比率的值变化在 2.2 cm -0.7 cm 。在静止状态细菌纤维素合成可以通过一步(培养基中含 5–10% 细胞悬液)或两步程序来完成。后者是从搅拌发酵开始的,然后是静止培养 (Okiyama et al., 1992 ) Krystynowicz et al. ( 1997 ) 改良了这两步程序并且所应用的细胞,是在两步程序静止培养中得到的。薄膜含有 A. xylinum E ,第一步( 24h ),切下一致的片并用作启动下次培养的第接种物,运行 4-5 天。这方法能提供均匀的细菌生长并产生一致的膜片。
在静止培养中细菌纤维素合成的控制是非常困难的,因为膜片是浸进液体培养基中。一特别重要参数,需要持续控制,就是 pH
pH 值对生长和多糖合成有最佳影响。因为 pH 调节的常规方法不能用于静止培养, Vandamme 等人 ( 1998 ) 应用一种内部 pH 控制,是通过最佳发酵培养基设计,放入乙酸作为 Acetobacter sp. LMG1518d 的附加物。乙酸代谢产物阻止了由酮 - 葡萄糖酸盐形成引起的 pH 降低,并为生长培养基全程提供了 5.5 恒定的 pH
更好的细菌纤维素合成控制能在特殊发酵罐中取得。在水平发酵罐中产生 的纤维素,它提供了静止和浸没相结合的培养。这聚合物是在沿长轴旋转的滚筒或圆盘表面之上 (Figure 14 ) 。它的表面部分暂时浸泡在液体培养基中或是在其表面(空气中)之上。这方法的优势包括有更大聚合物表面,纤维素合成是一型中空纤维,不同直径及好的程序控制,容易规模化,对细菌附着和产生沉积有事宜表面,有更好的基质利用,更高速率产生纤维素,可以补充营养,在加工过程有更多通气,等等。 (Sattler Fiedler, 1990 ) Bungay Serafica ( 1997 ) 在一升盘(直径 12 cm )发酵器中生产细菌纤维素并且表明最佳糖(蔗糖或葡萄糖)浓度是 10 g L ,圆盘转速 12 r.p.m. 和恒定 pH 5.0 Krystynowicz 等人 ( 1997 ) 成功应用 11- 升反应器含有细菌纤维素菌株 H-S 培养基 3 (Figure 15 ) 。它的 11 个盘(每个直径 12 cm )最佳转速大约 3 r.p.m A. xylinum E25 合成纤维素干重,在生长 7 天之后得到多达 4.2 g L
14. 在水平发酵器中滚轴表面形成 A. xylinum 纤维素。
15. 在旋转盘发酵器中盘沉积 A. xylinum 纤维素。
在深层培养中细菌纤维素的产生通常需要普通发酵罐,装备有某些静力部分(挡板,刀片等),能使细胞粘附,因为纤维素在自由水相中合成通常是滴状的。同样,在各种水不溶微粒,如沙,硅藻土或是玻璃珠,加入到培养基中,会增加细菌纤维素的产生,因为细菌在颗粒上形成的生物膜大概受限于氧传输,并且葡萄糖氧化葡萄酸停止 (Vandamme 等人 1998 )
大规模纤维素生产,用持续搅拌和通气的发酵罐会遇到许多问题,包括自然发生细胞突变,造成纤维素生产衰退。最佳搅拌和充气能防止动荡,波动会在纤维素聚合和结晶有负面影响,能降低多糖产量。例如,搅拌速率达到 60 r.p.m. 和充气每分钟每容量 0.6 容量 (v.v.m.) A. aceti ssp. xylinum ATCC 2178 株在一 300-L 发酵罐在 30 °C 培养 45 小时和得到 10 g BC L d(Laboureur, 1988 ) Ben-Bassat 等人 ( 1989 ) 研究在 14-L Chemap 发酵罐中 A. xylinum 1306–21 株细菌纤维素生产,在含葡萄糖和 CSL 2% CSL 培养基中培养。搅拌速率相对于 900 r.p.m. 和溶解氧浓度相对于 30% 气体饱和。聚合物收量 5.1 g L d Chao 等人( 2000 )应用一 50-L 内部环流反应罐用 A. xylinum sp. BPR2001 株细菌纤维素合成。用浓缩氧气体充气, 67 小时之后,纤维素收量从 3.8 增加到 8 g L
在发酵罐细菌纤维素产生遇到真菌或链霉菌培养类似搅拌问题,因为这些微生物多数生长小球或细丝形及它的培养基变为非牛顿液体。在各种形状颗粒的浓稠悬液中形成高浓度菌丝限制搅拌和气体输送。搅拌速率增加以改善充气和由于剪力引起的产品结构破坏。 Bauer 等人 ( 1992 ) 把这情况加以考虑并在生长培养基中加入聚丙烯酰胺保护剂,用于发酵罐中细菌纤维素合成。这种保护剂减少了剪力破坏并影响特别高密度生产是否定的,因为使细胞生长率降低。
某些代谢物的积累也能影响纤维素的产生。例如, Kouda 等人 ( 1998 ) 研究表明高分压二氧化碳对 A. xylinum 生长有负面影响并且减少细菌纤维素收量。
Laboureur (1998) 开发了一种方法应用 A. xylinum sp. ATCC 21780 株在 300- 500-L 发酵罐,培养基含 5% 蔗糖, 0.05% 酵母提取物, 0.2% 枸橼酸,氮盐,镁和磷酸盐,生产细菌纤维素。培养基用 12% 接种物接种,培养 160 小时。这过程是在 30°C 运行 45 小时和 pH 4.8, 和充气速率 0.6 v.v.m 。细菌纤维素合成收量达 18 g L d (10 g L d). 另外菌株 Acetobacter sp. ATCC 8303, 28 °C pH 4.6, 生长,应用改良培养基,含 0.28% 葡萄糖, 0.07% 麦芽糖, 0.03% CSL, 0.03% 酵母提取物。充气开始是 1 v.v.m.33 小时和这过程的最后是 0.5 v.v.m ,细菌纤维素的收量是 13 g L d
向大容量发酵罐准备适宜细胞密度的接种物也是个问题,主要是因为是包裹在纤维素之中。为释放细胞和增加其密度, Brown ( 1989c ) 应用纤维素酶制剂使部分纤维素溶解。有这些酶存在时,细胞密度达到 10mL, 而缺失酶时,只有 1.12 10 mL, 在生长 30 小时之后。
除了上述方法之外,各种直径中空原纤维形的纤维素生产也在试验 (Yamanaka 等人 1990 ) 。这样的材料对小直径血管的生产应该是特别有益的。这中空细菌纤维素原纤维素在一种氧可渗透空心载体的内和 / 或外表面细菌纤维素产生菌生长得到的,产生形状,例如,玻璃纸,特氟龙,硅树脂,陶瓷等。
9.2.4 . 连续培养
微生物纤维素也能做静止连续培养产生 (Sakair 等人 1998 ) A.xylinum 株在一些盘上生长,在 S-H 培养基中, 2 天之后在表面获得薄膜产生,通过十二烷基磺酸钠洗浴以杀死细胞并放在通风滚筒上。这过程继续几周,滚动速率 35 mm h
和每 8-12 小时把新鲜 S-H 培养基加入盘中以保持其最佳水平。应用这方法可以收集大于 5 m 的纤维素细丝,指出它有工业应用潜力。
9.3. 外部生物合成
纤维素外部合成是纤维素研究领域最困难题目之一。第一,纤维素合成是利用纤维素酶“逆作用”, Kobayashi 等人 ( 1991 ) 作为催化剂,虽然化学合成方法在以前已应用。几种单体和催化剂已应用 (Nakatsubo 等人 1989 ), 但都没有得到理想产品, β -1,4- 链接葡糖吡喃糖的立体定向聚合物。外部细菌纤维素合成的想法是从应用 A. xylinum 无细胞提取物 (Glaser, 1958 ), 膜的粗制 (Colvin, 1980 ;Swissa 等人 1980 ; Aloni 等人 1982 ) ,和用洋地黄皂苷膜溶解物实验得来的 (Aloni 等人 1983 ) 。这些研究证明 UDPGlc A. xylinum 纤维素合成基质, c-di-GMP 是特异催化剂 (Ross 等人, 1987 ), 及钙和镁离子对这过程是至关重要的 (Swissa 等人 , 1980 ) 。外部合成是用洋地黄皂苷溶解 A. xylinum 细胞膜进行的 (Lin 等人 , 1985 ) ,得到纤维素纤维直径 17 ± 2 Å
9.4. 化学 - 酶合成
在纤维素化学合成实验中尚未得到预期结果。分支和低分子量葡聚 (Husemann Muller, 1966 ) β -1,4- and α -1,4- 链接葡糖吡喃糖的聚合物 (Micheel Brodde, 1974 ) 被得到。
 
Kobayashi 等人 ( 1991 ) 成功实验指出,应用联合化学和酶方法可以导致纤维素外部合成的商业发展。
作者应用 β -D- cellobiosyl 氟化物,通过化学合成方法得到,一种基质和 T. reesei 纤维素 , 在水 - 有机溶剂系统 ( 乙酸缓冲液 pH 5.0 和氰化钾烷, 1:5 v/v 的一种混合物 ) 中催化并获得水不溶“合成纤维素”,用 DP > 22. X- 线 C-NMR 分析表明这产物是纤维素 II
作者叙述产品的 DP 取决于反应条件,特别是水 - 有机溶剂成分。他们发现更高浓度基质和乙腈存在,这纤维素酶,作用如糖基转移酶 - 主要产生可溶纤维低聚多糖 (DP 8) ,还可发现许多用途。虽然这些研究没能继续,由 Kobayashi 提出的方法对外部纤维素产生对所有酶有望做出选择。
 
9.5. 预期未来应用的产品加工
最近,一大规模细菌纤维素生产独创方法是由 Nichols Singletary ( 1998 ) 提出的,应用转基因植物结构专利想法去生产这种聚合物的可能性。作者想表达三种 A. xylinum CS 基因 (bcsA, bcsB, bcsC , 7.4 ) 和在作物(马铃薯,玉米,燕麦,高粱,小米,小麦,稻,甘蔗等)的存储组织(根,块茎,谷粒)中两个 A. xylinum 二甲脒基环化酶基因。他们设想得到大量纯聚合物,容易和廉价收获。按照他们的方法,生产要比发酵法更便宜。作者还强调他们的程序在生态学方面,因为纯纤维素生产转基因植物的培育的附加利益,将比使用森林资源更经济。
9.6. 复原和纯化
经过静止或搅拌培养得到的微生物纤维素不是很纯并含有某些杂质,像培养基成分和 A. xylinum 完整细胞。在用于医药,食品加工,或甚至造纸业之前,必须去除所有这些杂质。
最广泛应用纯化方法之一是基于用 NaOH ,稀释酸,氢氧化物(以钠和钾为主),氯化钠或次氯酸溶液,有机溶剂或热水处理细菌纤维素。这些试剂可以单独或联合使用。 (Yamanaka 等人 1990 ) 。细菌纤维素浸泡在这样溶液中( 14-18 小时,某些情况达 24 小时),升高温度( 55–65 °C )能明显减少细胞数和着色程度。
还有报道预先用自来水冲洗之后在 2% NaOH 溶液中煮沸 (Yamanaka 等人 1989 ) Watanabe 等人 ( 1998a ) 这聚合物在 0.1 NaOH 80 °C 浸泡 20 分钟然后用蒸馏水洗涤。 Takai 等人 ( 1997 ) 用蒸馏水和 2% NaOH 处理细菌纤维素,用 2% 乙酸中和这膜。
Krystynowicz 等人 . ( 1997 ) 开发了一种程序开始用自来水清洗初始细菌纤维素(过夜),随后在 1% NaOH 溶液中煮沸 2 小时,在自来水中洗涤以彻底去除 NaOH 1 天),用 5% 醋酸中和,再用自来水去除它。获得的最终细菌纤维素制剂含有不足 3% 的蛋白,适于某些食品和医药目的。
细菌纤维素医学应用需要特殊处理以去除细菌细胞和毒素,因为它们能引起热源反应。最有效的方法之一是开始用可吸收的片材从两面轻轻压挤纤维素膜以排除 80% 的液相,然后把膜垫浸泡在 3% NaOH 12 小时。这过程要重复 3 次,之后把膜片浸泡在 3% HCl 溶液中,挤压并在蒸馏水中彻底清洗。
纯净膜经高压消毒或是钴 60 照射。它可作为良好的创伤绷带,因为它仅含 1–50 ng 脂多糖内毒素,而应用常规方法纯化细菌纤维素通常会含有 30 µg 或是更多的这些物质。 (Ring et al., 1986 ).
10 .特性
细菌纤维素是一种非常难溶解、有弹性和易伸缩的聚合物,有很强拉力。它是网状结构,是由高度结晶和高度单向纤维素亚原纤维组成大量的带状原纤维。这是三维结构,在植物原纤维素是看不到的,这导致了细菌纤维素高结晶指数 (60–70%) 。而且,植物聚合物纤维比细菌纤维素的微纤维要粗 100 倍,因此细菌聚合物有大 200 倍的可及面。以搅拌培养 A. xylinum 纤维素做比较,在静止状态下聚合物合成,有更高 DP( 各为 14,400 10,900) 、结晶指数(各为 71 63% )、拉力强度( Young's 系数各为 33.3 28.3 )、但有低水容性(每克细菌纤维素各为 34 170 )和在它分解形态悬浮粘度(各为 0.04 0.52 Pa s, (Watanabe et al., 1998a )
微生物纤维素表现是凝胶状的,因为它的液体成分(通常是水)存在于非常细小的带的空洞中,重量至少在 95% 。细菌多糖有高容水性,但大部分水不与聚合物结合,用轻微压力就可以挤出。干燥的细菌纤维素可形成纸片形状,厚 0.01–0.5 mm(Yamanaka et al., 1990 ; Krystynowicz et al., 1995 , 1997 ) 并有良好吸收特性。除了有高 Young's 系数外,细菌纤维素还显示有高音速并且因为这些独特机械特性,它能应用于声膜 (Vandamme et al., 1998 ).
细菌纤维素的特性在它合成期间和培养期间完全被改变。某些成分,像纤维素衍生物、磺酸、烷基磷酸盐、或其它多糖(淀粉、右旋糖酐)、可以进入营养液中改变其肉眼形态、伸展力、光密度和最终产物的吸收特性 (Yamanaka et al., 2000 ) 。细菌纤维素还能与其它物质结合,加入湿或干的纤维素,以得到理想的理化特性成分 Yamanaka, 1990 ) 。为了这个目的应用的添加物是由各种各样的无机和有机成分组成,像铝、玻璃、琼脂、海藻酸盐、 carragenan 、支链淀粉、葡聚糖、聚丙烯酰胺、肝素、 polyhydroxylalcohols 、明胶、胶原等。它们通过注入、迭片或是吸收、或是与分解聚合物混合,与细菌纤维素片组合。这复合材料能进一步使之成形处理,于是可得到各种产品。
近来, Kim 等人( 1999 )报告应用 L. mesenteroides ( 葡聚糖产生菌 )dextransucrase (葡聚糖生成酶) alternansucrase (交替蔗糖酶)改变细菌纤维素的酶促方法。在有 A. xylinum ATCC 10821 存在时合成“可溶纤维素”,由 1,4-, 1,6-, and 1,3- 链接单体组成葡聚糖。
 
细菌纤维素基本特性见表 2.
2. 细菌纤维素特性
高纯度
高结晶度
比传统木纸浆有更大面积
薄片密度 300 900 kg m
高拉伸强度,即使是在低薄片密度( 500 kg m 以下
高吸收力
高结合水能力
高弹性、顺应性和耐久性
无毒性
代谢惰性
生物相容性
易生物降解
维持良好形状
容易剪裁的理化特性
 
11 .应用
细菌纤维素公认是安全 (GRAS) 多糖并因此它早已有各种各样应用。它的商业应用就是这聚合物的独特性质决定的并且根据在廉价废料改良细菌菌株的生长使生产的有效技术的发展。细菌纤维素的优点是它的化学纯度和没有在植物多糖中通常存在的物质,那需要费力提纯。除了细菌纤维素膜片形状之外,它的面积和厚度,可以通过培养条件来定制。
在它生物合成期间相对容易使细菌纤维素改变,对一些特性如分子聚集、弹性、顺应性、容水能力、结晶度指数等进行规定。细菌纤维素微纤维可于低分子量物质和聚合物结合,这例子是加入生长培养基中,于是得到新奇商品。细菌纤维素也是未来化学变型的原料。
 
估计,在一公顷(一万平方米)表面区域每年从静止培养可得到多达 10,000 kg (公斤)( 10 吨)细菌聚合物而在同样时间、同样区域、棉花只能收获 600 kg (公斤)( 16.6 倍),细菌纤维素的广泛应用前景变得越来越明显。
细菌纤维素的主要潜在应用概述在表 3.
 
3. 细菌纤维素应用
部门应用:
化妆品:乳剂稳定剂如面霜、滋补剂、护甲素和亮光剂、人造指甲成分。
纺织工业、人造皮肤和织品、高吸附材料。
旅游和运动:运动衣、帐篷和野营器材。
矿业和炼油厂废物、溢出油收集海绵毒素处理吸收和矿物质和油回收材料。
污水净化:城市污水净化和水超滤。
麦克风和立体声耳机播放灵敏膜片。
林业:人造木村替代品、多层胶合板和耐用容器。
造纸工业:专业纸、档案文件修复、极耐用钞票、尿布和餐巾纸。
机械工业:车体、飞机部件和火箭壳裂缝密封。
食品生产:食用纤维素和椰果( ‘nata de coco’ )。
医药:褥疮、烧伤和溃疡治疗的暂时人造皮肤,牙齿成分和动脉植入物。
实验室 / 研究蛋白固定、色谱技术和体外组织培养介质成分。
 
11.1 .科技应用
与植物纤维素片材相比,细菌纤维素即使是在低密度板也有满意拉力。 (300–500 kg m) (Johnson and Neogi, 1989 ) 。因此,细菌纤维素是造纸的极好成分,能提供更好机械特性。细菌聚合物的微纤维形成大量氢结合物,当纸被干燥,就得到改善化学粘附和拉力强度。含细菌纤维素的纸不仅表明对固体添加物有更好抵抗,如填料和染料,而且还有更大弹性、可透气、抗撕裂和充暴力、能结合更多水 (Iguchi et al., 2000 )
 
有益作用如改善抗老化抵抗力,通过在棉花纤维加入小量细菌纤维素来达到,能得到手工制作纸,用于古老文档修复。这纸张显示适宜墨水承受力和特定撕扯 (Krystynowicz et al., 1997 ) 。这纸含有 1% 细菌纤维素就能满足对信息和文件纸
国际标准 ISO 9706:1994 ,特定撕扯可与抹布纸相比。可能用细菌纤维素加压制模,及用作电绝缘材料的板纸生产和封皮。
 
细菌纤维素还能用于特殊纸张的表面包覆。为此,细菌纤维素过滤悬液(匀质并与其它成分混合)被加入,应用一特殊涂抹器,或是里面是湿板结构,或是部分或全部是干燥板。包被改善性质如光泽、亮度、平滑、多孔性、墨水承受性、和张力。其它添加剂像淀粉、有机聚合物、包括羧甲基纤维素、有机、或是无机色素也可应用。 Johnson and Neogi ( 1989 ) 声称用 3% 细菌纤维素(固体物质)包被的纸显示有光泽性能和表明强度与有 20% 传统涂层的影印纸类似。该作者还叙述用细菌纤维素和羧甲基纤维素做包被甚至有更好特性,因为它们有协同作用。
 
细菌纤维素也是合成纸的重要成分 (Iguchi et al., 2000 ) ,自无极性聚丙烯和聚乙烯纤维,提供绝缘、耐热和阻燃特性,不能形成氢键。这型纸的木浆量通常是 20-50% 达到优良质量。应用细菌纤维素能使添加剂的量减少而对合成纸特性没有任何影响。
细菌纤维素在无纺布样产品也表明是良好粘合剂 (Yamanaka et al., 1990 ) 通常用于外科洞巾和大褂并含有各种亲水和疏水性、天然和人造纤维,像纤维素酯、聚烯烃、尼龙、有机玻璃、或是金属纤维。甚至小量细菌纤维素就能改善织物拉力和撕扯强度,例如, 10% 细菌聚合物相当于 20-30% 乳剂粘合剂。
 
细菌纤维素应用范围可以更广泛,因为它在合成期间是可变化的 (Brown, 1989a ,
1989b ) 。为此,羧甲基纤维素或是糖类共聚物和草酸可以直接加入到培养基中 (Yamanaka et al., 1989 ) 。有羧甲基纤维素存在得到的纤维素并有有机溶剂干燥有弹性和伸缩力特征及更高容水力(更快吸收更多的水)。最佳羧甲基纤维素浓度范围从 0.1 to 5% (w/v) 。有机溶剂的极性也能影响细菌纤维素的特性。用丙酮处理聚合物之后有弹性和橡胶样,而用无水乙醇干燥之后细菌纤维素像皮革。
因为细菌纤维素对酶消化敏感,被改变会得到各种满意生物降解力和强度的复合材料。这些产品的产生是根据纤维素和共聚物或是在含共聚物培养基中培养能产生细菌纤维素菌株之间的化学反应来决定的。
 
11.2 .医学应用
从静止培养得到的纤维素膜片是容易应用的,是天然“编织”创伤敷料,适合现代创伤敷料标准 (Figure 16 ) 。它是可灭菌、生物相容性、多孔、有弹性、容易操作和贮存、吸附分泌物、提供最佳湿度,这些都是创伤快速康复、防止次生感染和机械损伤、不会粘附新生组织、烧伤热吸附可缓解疼痛的重要因素。细菌纤维素片对固定加速康复过程的药剂也是极好的载体。
16 。纤维素膜片是创伤敷料的材料
 
因为细菌纤维素能有各种大小,它相对容易生产对于广泛创伤的敷料。因为近来动物源产品、胶原敷料的问题,可由细菌纤维素之一取代。这论点受到临床试验真实肯定结果额外支持。例如,细菌纤维素制剂 Prima Cel ,由 Xylos 公司生产,按美国伦斯勒理工学院在治疗溃疡临床试验用作创伤敷料。得到的结果是满意的, 8 周之后有 54% 病人恢复和其余溃疡也都痊愈 (Jonas and Farah, 1998 )
生物敷料
 
A. xylinum 纤维素的其它商业产品,像 Biofil 表明作为皮肤移植物和三度烧伤治疗、溃疡、发现在恢复牙周和褥疮应用是极好的。另一制剂, Gengiflex 薄织物 (Jonas and Farah, 1998 ) Krystynowicz 等人 ( 2000 ) A. xylinum 纤维素制备薄膜调查指出 ( 17 ) 作为创伤敷料一般应用是可能的。
17 。应用细菌纤维素敷料治疗烧伤,康复之前 (a) 和之后 (b) (Krystynowicz
et al., 2000 ).
      
细菌纤维素中空管纤维用作人造血管和输尿管研究结果是有希望的 (Yamanaka et al., 1990 ) 。细菌纤维素的抗凝血特性(血液相容性)通过根据在成年狗血管(部分降主动脉和颈静脉)用细菌纤维素制造人造对应物更换的试验做出了评价。一个月之后人造脉管被取出并检查它的内表面血栓粘附状态。细菌纤维素血管保持很好的开通状态。
另一成功试验表明应用生物合成纤维素更换狗硬脑膜材料 (Jonas and Farah, 1998 )
 
因为它的高拉力强度、弹性、对液体和气体的可渗透性、干燥细菌纤维素用作生物传感器中附加膜保护固定的葡萄糖氧化酶,用以测定血液葡萄糖水平。这细菌纤维素膜在 10 倍稀释人血溶液可增强电极稳定性至 200 小时。其它商品保护膜,像 cuprophan(AKZO, England), 只提供电极稳定性 30 小时。在未稀释人血用 cuprophan 覆被的生物传感器稳定 3-4 小时。而细菌纤维素膜稳定性延长至 24 小时。
 
11.3 .食品应用
化学纯和可代谢惰性细菌纤维素已在食品加工中用作非卡如里膨胀和稳定剂。和植物多糖及其衍生物的纯制剂相似,它是用作泡沫、胶质和淀粉凝胶、乳胶的稳定作用,即罐装巧克力饮料和高汤、质感改变,即,果浆稠度改善、粘度增强、脂类取代,包括油类,和饮食纤维补充剂 (Ang and Miller, 1991 ; Kent et al., 1991 ; Krystynowicz et al., 1999 )
 
 
细菌纤维素在食品生产首次成功商业应用是“ nata de coco ( 椰果 ) (Sutherland, 1998 ) 。是菲律宾传统甜食,是从椰乳或含蔗糖的椰水制备的,适合产生细菌纤维素细菌的生长培养基。食用菌膜能保护抵抗结肠癌、动脉粥样硬化、冠状动脉栓塞和防止尿中葡萄糖突然升高。因此椰果在亚洲以外也是越来越受到欢迎。
另一种受到欢迎的含细菌纤维素食品是中国康普茶 ( 茶格瓦斯或茶菇 ) ,在茶和糖液中生长的酵母和醋酸菌得到。在表面形成的膜片含有对人体有益健康的纤维素和酶。它们的非生物活性对大肠和整个消化道有特殊刺激。康普茶对某些癌症有保护 (Iguchi et al., 2000 )
 
由一些作者提出的研究结果,应用由 A. xylinum 合成的 细菌纤维素膜片对葡萄酒和果汁滤过液,及多酚固定是有希望的 (Krystynowicz et al., 1999 ) 。生物活性花青素制剂,在饮食纤维中被浓缩,对功能食品是很好的。细菌纤维素还表明在面包产品中是有吸引力成分,因为它起着饮食纤维的作用,保留味道和气味并延长贮存期。
 
11.4 .其它应用
它有大的可触及的表面区、高度坚固、和超级吸附特性及通过物理或化学方法改变的可能性、这意味着细菌纤维素能用于生物催化剂固定载体。含有固定动物细胞的纤维素凝胶用于培养产生干扰素、白细胞介素 -1 、细胞抑制剂和单克隆抗体 (Iguchi et al., 2000 ) 。细菌纤维素还用于 Gluconobacter oxydans (氧化葡萄糖杆菌) , Acetobacter Methanolyticus (醋酸菌) Saccharomyces cerevisiae (啤酒酵母)细胞的吸附。固定菌株表明各自是葡糖酸盐(收量 84–92% )、二羟基丙酮(收量 90–98% )和乙醇(收量 88–92% )的有效产生菌,和表现很好操作和热稳定性。
 
纯化细菌纤维素可以是醋酸纤维素、硝化纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、甲基纤维素和羟基纤维素的合成原料 (Yamanaka, 1990 ) 。即使细菌纤维素是在有混合物存在产生的,受规律原纤维组装干扰和影响 β -1,4- 葡聚糖结构,例如羧甲基纤维素或其它纤维素衍生物,和其它碳水化合物(淀粉、葡聚糖)、硫酸盐和烃基磷酸盐、产生微生物聚合物是新奇的、添加剂 - 依赖和有益特性,包括光学透明或更高水结合能力,甚至重复浸湿和干燥之后。细菌纤维素在化学、造纸和纺织工业的潜在应用是根据它价格和易取性。为适合这些需求,细菌纤维素必定是由高效菌株产生、是生长在廉价培养基中、在复杂表面、固态或深层发酵 (Vandamme et al., 1998 )
 
12 .专利
对细菌纤维素的兴趣快速增长,反应在专利数量上(自 1980 年以来,每年大约有 20 件)和这种独特聚合物的专门出版物(近 10 年每年 20-40 本) (Iguchi et al., 2000 ) 。某些关于细菌纤维素生物合成、特性和应用专利见表 4. 这些专利在章节中引用和在参考中列出。
13. 前景与展望
115 年前 (Brown, 1886 ) 报道第一篇科学论文是在许多国家“醋厂” (Yamanaka et al., 1989 ) 许多年就知道由醋酸菌形成一种特殊物质。进一步研究发现这种物质就是超纯纤维素。多糖生物合成物的代谢路径和复杂分子结构,以及它的迷人动力学初期链条联想到一种具有独特性质结构已有阐述。即使细菌纤维素进展和有限商业化必定发生,但相关生物技术、与现代工业对植物纤维素技术的竞争,尚未开发。
那么,怎样做 才能使细菌纤维素生产达到成功并实现商业化?首先 , 必须创建稳定超额生产聚合物菌株,应用分子遗传学和生物学新近成就。这些菌株必须能吸收广泛碳源并显示朝着自然突变向细胞突变是低倾向并在搅拌培养条件下能有效合成纤维素 (10–15 g Ld) 。新的静止和深层培养生物反应器的建造是必然的。
细菌纤维素生产成本要明显降低,用富含适宜碳源的工业废料取代昂贵营养培养基来获得、像结晶葡萄糖生产的废液等。同时,应该得到重要环境效益。然而,细菌纤维素大量生产的重要优势应该是对森林的保护,目前是在以惊人的速度在消失,因此导致土壤富营养化(污染灾害)和全球气候改变。
细菌纤维素早已具有多种用途,在回顾中提出。这种多糖不仅能取代某些动物聚合物(胶原)而且还可以携带对人体健康具有有益影响的物质(即抗氧化剂和益生元)。细菌聚合物在医学的用途(创伤、烧伤和溃疡敷料、移植物成分)已不成问题。而且,纤维素颗粒物能是药剂固定的极佳基质。例如,如果特殊物质(受体)被细菌纤维素吸附,所产生的分子能清除栖息在消化道里的毒素或病原微生物。近来,细菌纤维素独特纳米晶体 (30×600–800 nm) 商标 (Xylos)
选择性地得到,是从它的商品制剂 Prima Cel ,这些纳米晶体表面的修正物(三甲基硅烷)的衍生物,获得了它剩下的完整核心。这样修正过的晶体在几种先进科技有很大潜能。
破解纤维素生物合成的所有迷津将会导致细菌纤维素超分子结构和特性的剪裁和改善,作为结果,有关它的廉价生产和对它的体积和特殊应用的新奇理念将得以发展。

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